基于超广杂交捕获靶向测序的血流感染血浆病原体cfDNA高敏检测新策略

《Journal of Translational Medicine》：Ultra-broad hybrid capture-based targeted next-generation sequencing for sensitive plasma pathogen cfDNA detection in bloodstream infections

本研究针对血流感染（BSI）诊断中病原体细胞游离DNA（cfDNA）检测灵敏度不足的难题，开发了一种超广杂交捕获靶向测序（tNGS）技术。该技术通过覆盖1872种病原体的超广面板和高密度探针设计，在208例疑似BSI患者（含139例免疫缺陷者）中验证显示：tNGS与宏基因组测序（mNGS）检测一致性达93.75%，诊断准确率显著优于常规微生物检测（CMT）（76.44% vs. 45.67%, p<0.0001），且成本仅为mNGS的1/3-1/2。该技术为BSI尤其是免疫缺陷人群提供了经济高效的筛查工具，具有重要临床转化价值。

　　

血流感染（BSI）是危重症患者死亡的主要威胁之一，死亡率超过30%，尤其对免疫缺陷患者而言，其发病率高达28%，临床负担极重。当前，血培养作为BSI诊断的“金标准”却因耗时长（最多5天）、阳性率低（约22%）难以满足临床需求。尽管分子检测技术如宏基因组测序（mNGS）可实现无偏倚病原体筛查，但其高昂成本（单次检测约900美元）限制了广泛应用。靶向测序（tNGS）虽能通过探针富集病原体核酸信号降低成本，却因病原体面板覆盖有限和血浆cfDNA片段化特性，在BSI诊断中应用受限。

为突破这些瓶颈，魏沐云等人在《Journal of Translational Medicine》发表研究，开发了一种超广杂交捕获tNGS技术。该技术采用覆盖1872种病原体的超广面板，并通过高密度探针覆盖策略提升cfDNA片段捕获效率。研究团队通过回顾性分析208例疑似BSI患者（含139例免疫缺陷者）的血浆样本，以mNGS和常规微生物检测（CMT）为参照，系统性评估了tNGS的诊断性能。

关键技术方法

研究纳入上海交通大学医学院附属仁济医院2022年4月至2023年12月的住院患者血浆样本，通过cfDNA提取、文库构建后，使用Geneplus探针 panel进行杂交捕获，并在Gene+ Seq-100平台以5M reads深度测序。病原体判定阈值设定为常见病原体RPM≥6、真菌和分枝杆菌RPM≥0.5。对比mNGS（BGI平台，20-40M reads）及CMT（含血培养、PCR、G/GM试验），以复合临床诊断标准为金标准评估诊断效能。

研究结果

1. 病原体检测性能对比

tNGS共检测到190种病原体，阳性样本占比64.42%，与mNGS（177种病原体，62.50%样本）无显著差异（p=0.64），但显著高于CMT（32.21%, p<0.0001）。

显示，tNGS与mNGS检测一致性达93.75%（Kappa=0.794）。tNGS额外检出20种病原体（如胞内细菌），但对尿素原体等cfDNA片段分布特殊的病原体灵敏度较低。

2. 免疫缺陷人群覆盖能力

在免疫缺陷组中，tNGS检出92.09%的mNGS已知病原体，仅漏检5种病原体，其中2种未包含于探针面板（如罕见真菌）。

表明免疫缺陷组病原谱更广（49 vs. 29种），但tNGS在两组中诊断准确率均与mNGS相当（77.70% vs. 76.98%, p=0.886）。

3. BSI诊断效能

以复合临床标准为参照，tNGS对BSI的整体诊断准确率为76.44%，与mNGS（75.00%）无统计学差异，但显著优于CMT（45.67%, p<0.0001）。

进一步显示，tNGS对细菌性BSI诊断准确率显著高于CMT，对真菌性BSI灵敏度提升至67.44%（CMT为41.86%）。

4. 临床影响与成本分析

模拟临床决策显示，tNGS结果与mNGS一致性达97.20%，可能影响70.92%患者的抗生素策略（如目标治疗调整或感染排除）。此外，tNGS额外检出18个耐药基因，但其临床价值需进一步验证。成本方面，tNGS检测费用约为200美元，仅为mNGS（900美元）的1/3-1/2。

结论与展望

该研究证实超广杂交捕获tNGS在BSI诊断中具有与mNGS相当的灵敏度与准确性，且成本显著降低。其超广病原体面板较好地覆盖了免疫缺陷人群需求，但仍存在探针边缘覆盖不足导致的漏检风险（如片段化真菌DNA）。未来需通过优化探针设计进一步提升覆盖率，并通过前瞻性多中心研究验证其临床效用。该技术为BSI的早期经济筛查提供了新路径，尤其适用于资源有限场景下的感染病原体快速鉴定。