尼古丁通过增强自噬流抑制GSDME-N诱导的线粒体神经毒性在早期神经退行性变中的作用

《Journal of Translational Medicine》：GSDME-N-induced mitochondrial neurotoxicity in early neurodegeneration was suppressed by nicotine via enhancing autophagic flux

本研究针对帕金森病(PD)早期神经突退缩这一关键病理事件，探讨了Gasdermin E氨基末端结构域(GSDME-N)介导的线粒体神经毒性机制。研究人员通过体外细胞模型和体内动物实验证实，尼古丁能够激活自噬通路促进GSDME-N清除，从而维持线粒体膜电位(ΔΨm)、降低活性氧(ROS)产生，显著改善rotenone诱导的神经退行性变。该发现揭示了GSDME-N作为PD早期干预新靶点的重要价值，为神经保护策略提供了全新思路。

　　

在神经退行性疾病研究领域，帕金森病(PD)作为一种常见的运动障碍性疾病，其病理特征表现为黑质多巴胺能神经元的进行性丢失。值得注意的是，神经元死亡并非一蹴而就，而是经历一个慢性、渐进的过程，其中神经突（包括轴突和树突）的退缩被认为是神经退行性变的早期关键事件。然而，驱动这一早期病理变化的具体分子机制尚未完全阐明，这严重制约了PD的早期诊断和干预策略的开发。

近年来，科学家们将目光投向线粒体功能障碍这一PD的核心病理环节。作为细胞的"能量工厂"，线粒体在维持神经元存活和功能中扮演着至关重要的角色。当线粒体受损时，会触发一系列级联反应，包括细胞色素c的释放和caspase-3的激活。特别有趣的是，研究发现在神经退行性变的早期阶段，caspase-3的激活具有空间特异性——它首先发生在神经突内，进而引发局部线粒体崩溃和神经突退化，这一过程远在细胞整体死亡之前。

Gasdermin E(GSDME)作为caspase-3的下游切割底物，在神经元中高度富集。当GSDME被caspase-3切割后，其N端结构域(GSDME-N)会被释放出来。在非神经元细胞中，GSDME-N主要通过形成质膜孔洞诱导细胞焦亡。然而，在神经元中，GSDME-N却表现出独特的亚细胞定位特征——它优先靶向线粒体，在线粒体膜上形成孔洞，导致线粒体功能障碍，进而引发神经突退缩。这一发现提示我们，GSDME-N可能是连接早期线粒体损伤与神经突退缩的关键分子。

另一方面，流行病学研究揭示了一个令人费解的"吸烟悖论"——尽管吸烟对健康有多重危害，但吸烟者患PD的风险却显著降低。尼古丁作为烟草中的主要生物碱成分，被证实具有神经保护作用，但其具体作用机制仍不明确。特别值得注意的是，这种保护效应主要发生在PD临床诊断之前，暗示尼古丁可能通过调节早期神经退行性变过程发挥保护作用。

那么，尼古丁的神经保护作用是否与调控GSDME-N有关？它又是通过何种机制来干预早期神经退行性变过程的？为了回答这些科学问题，首都医科大学的研究团队在《Journal of Translational Medicine》上发表了最新研究成果。

本研究主要采用了以下关键技术方法：通过rotenone诱导建立PD体外模型（SH-SY5Y细胞、原代皮层神经元）和体内模型（C57BL/6小鼠）；利用蛋白质印迹(Western blot)和线粒体分离技术检测GSDME-N的表达和定位；采用JC-1和TMRM荧光探针评估线粒体膜电位；使用MitoSOX Red检测线粒体活性氧水平；通过免疫荧光染色结合MAP2标记进行神经突形态学分析；应用自噬抑制剂3-MA验证自噬通路的作用；通过行为学测试（旋转棒、悬丝、爬杆试验）评估小鼠运动功能；采用免疫组化检测酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元。

GSDME切割和线粒体功能障碍发生在明显细胞死亡之前

研究人员首先在原代皮层神经元中建立了rotenone诱导的PD模型。通过MTT法和LDH释放检测，他们发现0.05μM的rotenone处理12-24小时仅引起轻微的细胞活力下降，而未导致明显的细胞死亡，这恰好模拟了早期神经退行性变的状态。在这一亚致死条件下，可以检测到caspase-3和GSDME的明显切割，表明GSDME的激活确实发生在明显的细胞死亡特征出现之前。

进一步使用JC-1探针检测线粒体膜电位发现，rotenone处理组红色/绿色荧光强度比值显著降低，提示线粒体跨膜电位下降。在SH-SY5Y细胞系中，研究人员也观察到类似现象：rotenone处理（0.5-10μM，12小时）显著增加GSDME-N水平并降低线粒体膜电位，但这些条件下并未引起明显的LDH释放。这些结果共同表明，在早期神经退行性变阶段，GSDME切割和线粒体功能障碍已经发生，但细胞整体存活尚未受到严重影响。

尼古丁阻止GSDME-N在线粒体上的积累并挽救线粒体功能障碍

为了探究GSDME-N对线粒体功能的具体影响，研究人员在SH-SY5Y细胞中过表达了GFP标记的GSDME-N。共聚焦显微镜显示，GSDME-N主要形成细胞内斑点状结构并积累在线粒体上，而全长GSDME则呈弥散分布。功能实验表明，GSDME-N的表达导致线粒体膜电位降低和线粒体活性氧(mROS)增加，证实了GSDME-N确实能够诱导线粒体功能障碍。

接下来，研究人员测试了尼古丁的保护作用。结果显示，尼古丁处理能够浓度依赖性地阻止rotenone引起的线粒体膜电位下降。更重要的是，尼古丁（10-50μM）显著降低了rotenone诱导的GSDME-N水平。通过GFP-GSDME转染实验，研究人员直观地观察到rotenone处理触发了GFP-GSDME斑点状结构的形成，这些斑点与MitoTracker Red标记的线粒体共定位，而尼古丁处理则明显减少了这种共定位现象。线粒体分离实验进一步证实，尼古丁显著降低了线粒体组分中的GSDME-N水平。

自噬通路参与尼古丁对GSDME-N线粒体积累的抑制作用

考虑到自噬专门负责清除聚集的膜蛋白和受损细胞器，研究人员推测尼古丁可能通过自噬通路来清除GSDME-N。共聚焦显微镜观察发现，尼古丁处理诱导了自噬标记物LC3B斑点与GFP-GSDME斑点在线粒体上的共定位。蛋白质印迹分析显示，尼古丁促进了LC3-I向LC3-II的转化，并降低了P62水平，表明自噬流被激活。特别重要的是，自噬抑制剂3-MA能够逆转尼古丁对GSDME-N的降解作用。

功能上，3-MA处理也阻断了尼古丁对线粒体膜电位的保护作用，并加剧了GSDME-N在线粒体上的积累。同时，3-MA逆转了尼古丁对mROS的降低效应。这些结果充分证明，尼古丁通过激活自噬通路来清除线粒体上的GSDME-N，从而保护线粒体免受毒素损伤。

尼古丁通过清除线粒体GSDME-N维持神经突完整性

在原代神经元中，尼古丁（10-50μM）同样能够下调rotenone诱导的GSDME切割。通过GFP-GSDME转染和免疫荧光染色，研究人员观察到rotenone处理导致GFP-GSDME斑点与神经突内线粒体共定位，而尼古丁处理则招募LC3B到这些聚集的线粒体上，促进其清除。蛋白质印迹结果再次证实，尼古丁激活了自噬通路，而3-MA能够逆转这一效应。

神经突形态学分析显示，rotenone处理引起神经突缩短和数量减少，而尼古丁有效减轻了这些神经突异常。线粒体形态学测量发现，rotenone导致神经突内线粒体面积和周长显著增加，而尼古丁处理阻止了这种线粒体肿胀。同时，尼古丁还改善了rotenone引起的线粒体逆向运输障碍。这些结果共同表明，尼古丁通过清除线粒体上的GSDME-N，维持了神经突内线粒体功能，从而保护神经突完整性。

尼古丁在rotenone诱导的PD小鼠模型中下调GSDME-N并延缓神经退行性变进展

在动物水平上，研究人员通过给C57BL/6小鼠腹腔注射rotenone并在饮水中补充尼古丁，建立了PD模型。结果显示，rotenone处理7天后，中脑组织中的GSDME-N水平就显著升高，而此时TH阳性神经元和纤维尚未出现明显丢失。尼古丁处理能够逆转GSDME-N的升高。到处理14天时，rotenone引起了明显的TH阳性神经元和纤维丢失，而尼古丁处理显著减轻了这种神经退行性变。

行为学测试进一步证实了尼古丁的保护作用：rotenone处理小鼠在旋转棒试验和悬丝试验中停留时间显著缩短，在爬杆试验中下行时间延长，而尼古丁处理改善了这些运动功能障碍。

这项研究深入揭示了GSDME-N在PD早期神经退行性变中的关键作用，并阐明了尼古丁通过激活自噬通路清除GSDME-N的神经保护机制。该研究不仅为理解PD早期病理过程提供了新的分子视角，也为开发针对早期神经退行性变的干预策略提供了重要靶点。值得注意的是，虽然尼古丁在本研究中显示出良好的保护效果，但由于其成瘾性和其他健康风险，并不能直接作为治疗药物使用。未来研究应该致力于开发更安全、更特异的GSDME-N调节剂，为PD的早期干预开辟新的治疗途径。

研究还提示，自噬通路在维持神经元稳态中发挥着至关重要的作用。在PD患者中，自噬流障碍可能导致异常蛋白聚集和线粒体功能障碍，因此，通过药物手段增强自噬可能成为神经保护的重要策略。此外，GSDME-N作为早期神经退行性变的生物标志物也值得进一步探索，这可能为PD的早期诊断提供新的工具。

总之，这项研究通过多层次的实验证据，确立了GSDME-N-自噬轴在PD早期病理过程中的重要地位，为理解神经退行性变的起始机制提供了新的理论框架，也为开发早期干预策略指明了新的方向。