候选门级辐射细菌在好氧条件下的广泛适应性研究揭示地下水微生物组新认知

《Microbiome》：Growth of candidate phyla radiation bacteria in groundwater incubations reveals widespread adaptations to oxic conditions

本研究针对候选门级辐射(CPR)细菌在实验室培养中难以存活的问题，通过对397个地下水培养样本的系统分析，发现CPR细菌不仅能在好氧条件下生存，还能活跃生长。研究人员通过16S rRNA基因测序和定量PCR技术，揭示了CPR细菌在好氧培养中达到更高绝对丰度的现象，并通过宏基因组分析发现62%的CPR基因与好氧代谢相关，挑战了CPR为严格厌氧菌的传统认知。该研究为理解CPR细菌的生态适应性提供了新视角，对微生物资源开发具有重要意义。

　　

在地球的地下深处，存在着一个神秘而庞大的微生物世界——候选门级辐射(CPR)细菌。这些微生物虽然占据了地下水微生物组的半壁江山，却因其独特的生物学特性而长期笼罩在神秘面纱之下。CPR细菌具有超小的细胞尺寸（仅100-200纳米）和极度简化的基因组（小于1 Mbp），长期以来被认为是严格厌氧、发酵代谢的共生微生物，难以在实验室条件下培养。更令人困惑的是，尽管CPR细菌在天然地下水环境中繁衍生息，一旦转移到实验室培养体系中，其相对丰度就会急剧下降，这为科学家们研究其生态功能设置了巨大障碍。

德国耶拿大学水生生物地球微生物学研究所的Ekaterine Gabashvili等研究人员决心揭开这一谜团。他们通过对哈尼希临界区探索区地下水系统的长期观察发现，CPR细菌在从好氧到厌氧的氧化还原梯度中都能稳定存在，这一现象与它们被认为是严格厌氧菌的传统认知形成了鲜明对比。为了探究CPR细菌的真实生存策略，研究团队开展了一项规模空前的培养实验研究。

研究人员设计了31种不同的培养条件，包括22种好氧条件和9种厌氧条件，共收集了397个样本进行系统分析。这些培养实验持续时间从数天到三年不等，涵盖了自养、甲基营养、特定有机底物和复杂有机混合物四种主要处理类型。通过16S rRNA基因扩增子测序和定量PCR技术的结合使用，研究团队不仅能够追踪CPR细菌的相对丰度变化，还能精确计算其绝对丰度和生长速率。

令人惊讶的是，尽管CPR细菌在培养初期确实出现了预期中的丰度下降，但在长期培养过程中，它们表现出了强大的恢复能力。在好氧条件下培养的CPR细菌最终达到了比厌氧条件下更高的绝对丰度，这一发现彻底颠覆了人们对CPR细菌氧敏感性的传统认知。

研究的关键技术方法包括：从德国哈尼希临界区探索区两个监测井（H41和H52）采集地下水样本；通过16S rRNA基因V3-V5区扩增子测序（使用Bakt341F/Bakt785R引物对）和DADA2流程分析微生物群落组成；利用定量PCR（使用Bac8Fmod/Bac338Rabc引物对）测定绝对基因拷贝数；基于宏基因组组装基因组(MAGs)进行功能注释和代谢网络分析；通过SparCC算法构建微生物共现网络。

CPR在地下水培养中保持存活并生长

所有地下水培养实验都显示CPR相对丰度出现急剧下降，从原位最高51.3%降至培养1周后的6.4%。然而在延长培养时间后，相对丰度通常保持在4.7-12.0%范围内，个别样本甚至出现超过15%的富集现象，特别是在培养超过一年后，CPR丰度重新回到了原位观察到的水平范围。

定量PCR数据显示，自养和甲基营养处理中总细菌16S rRNA基因拷贝数从原位的1.0×10⁸（中位数）上升到培养后的1.1×10⁹/升，表明整个微生物群落都在活跃生长。通过结合相对CPR丰度和总16S rRNA基因拷贝数，研究人员估算出CPR的绝对基因拷贝数在自养处理中最高增加了两个数量级，达到1.7×10⁸/升，显著高于原位水平。

地下水培养维持了多样化的CPR类群

在所有处理和时间点中，地下水培养共检测到1410个CPR扩增子序列变异(ASVs)，涵盖了CPR的六个主要类别：候选Parcubacteria（791个ASVs）、ABY1（339个ASVs）、候选Gracilibacteria（165个ASVs）、候选Saccharimonadia（71个ASVs）、候选Berkelbacteria（30个ASVs）和候选Microgenomatia（3个ASVs）。不同处理条件支持特定的CPR类群生长，自养处理支持最高的CPR香农多样性，而特定处理则促进特定CPR类群的富集。

特定CPR ASVs因添加补充物而富集

硝酸盐和硫代硫酸盐的添加与44个CPR ASVs相关，其中14个候选Parcubacteria的ASVs显示出最强的相关性（R²：0.4-0.65）。土壤渗漏液添加与多种CPR ASVs相关，包括候选Parcubacteria（18个ASVs）、ABY1（10个ASVs）等。纤维素与31个ASVs相关，主要来自候选Saccharimonadia和候选Parcubacteria。好氧和厌氧条件的比较显示，102个ASVs与厌氧条件呈正相关，而仅有2个ASVs与好氧条件正相关。

CPR生长速率与其他地下水细菌相当

CPR和非CPR ASVs的倍增时间估计显示，两组都表现出广泛的范围。大多数CPR ASVs的倍增时间约为15天，但有些ASVs能够在1-2天内完成倍增。快速生长的CPR包括20个候选Parcubacteria ASVs、10个ABY1 ASVs和3个候选Gracilibacteria ASVs。CPR和非CPR的整体中位倍增时间无显著差异（15.4天 vs. 13.5天），表明在模拟天然地下水寡营养条件的培养环境中，CPR和非CPR细菌表现出可比较的生长动力学。

CPR与非CPR共现模式因处理和CPR谱系而异

CPR和非CPR之间的共现模式在不同处理间明显变化。自养处理中显著正共现有限，主要涉及候选Parcubacteria；甲基营养处理还显示ABY1的频繁共现；特定处理中候选Saccharimonadia共现；复杂处理显示最广泛的共现范围。与CPR共现的非CPR经常包括快速生长的生物体如伯克霍尔德菌目和假单胞菌目，以及拟杆菌门成员，后者特别是与候选Saccharimonadia共现。

好氧条件与CPR更高绝对丰度相关

尽管ASVs主要与好氧条件呈负相关，但所有观察到的五个主要CPR类别的ASVs在好氧条件下的中位绝对丰度都高于厌氧条件。候选Berkelbacteria和候选Saccharimonadia在好氧条件下的中位绝对丰度分别比厌氧条件高10倍和50倍，表明这些类群对氧气有特殊偏好。候选Parcubacteria、ABY1和候选Gracilibacteria在好氧条件下也显示出略微更高但显著的中位绝对丰度。

CPR MAGs具有利用氧气的反应基因

对587个CPR宏基因组组装基因组(MAGs)的功能特征调查发现，503个MAGs含有映射到需氧反应网络的基因，每个MAG中位数为2-7个基因。此外，每个MAG有25-71个基因映射到厌氧反应网络，11-51个基因映射到增强反应网络。深度分析发现编码直接利用氧气进行反应的酶基因，如L-天冬氨酸氧化酶、犬尿氨酸3-单加氧酶、吡哆胺5'-磷酸氧化酶、儿茶酚2,3-双加氧酶等。

映射到需氧反应网络的基因涉及氨基酸代谢、次级代谢物生物合成、脂多糖生物合成和碳水化合物代谢等多种功能。对偏好好氧条件的CPR类群（候选Saccharimonadia和候选Berkelbacteria）的基因组 repertoire 分析发现，呼吸链复合体IV基因（cyoABCD，qoxA）在候选Saccharimonadia中显著富集，存在于36-64%的MAGs中。F型ATP酶基因虽然在各种CPR中存在，同样在候选Saccharimonadia中富集。

研究结论表明，CPR细菌在实验室培养条件下表现出意想不到的生长能力和代谢灵活性。尽管在培养初期丰度下降，但多种CPR类群能够在长期培养中恢复并达到较高丰度，其生长速率与许多非CPR地下水细菌相当。更重要的是，研究结果挑战了CPR为严格厌氧菌的传统观点，证明了许多CPR类群不仅能在好氧条件下存活，还能达到比厌氧条件下更高的绝对丰度。

基因组分析进一步揭示了CPR具有 previously unappreciated 的氧相关代谢能力。多达62%的注释基因与好氧条件相关的功能有关，且发现了25个CPR基因组编码直接利用氧气的酶。这些发现表明，CPR细菌可能采用一种混合代谢策略，既保留其发酵代谢的核心特征，又整合了氧依赖性过程，这种代谢灵活性可能是其在各种环境中持久存在和生态成功的关键。

这项研究的重要意义在于重新定义了我们对CPR细菌生态生理学的理解，为未来针对性地培养和研究这些"微生物暗物质"提供了重要指导。研究结果表明，通过模拟天然寡营养条件并适当诱导宿主生物的饥饿状态，可能是在实验室中成功富集CPR的关键策略。此外，CPR在好氧环境中的活跃生长能力，扩展了我们对地下生态系统微生物能量流动和养分循环的认识，为理解全球地下生物地球化学循环提供了新的视角。