基因编码生物传感器助力芳香酸MFS转运蛋白的挖掘、表征与工程化改造

《Journal of Biological Engineering》：Genetically encoded biosensor enabled mining, characterisation and engineering of aromatic acid MFS transporters

本研究针对微生物细胞工厂中芳香酸底物跨膜运输效率低下的瓶颈，开发了一种基于基因编码生物传感器的高通量筛选平台。研究人员通过同线性分析和生物传感器技术，成功挖掘并表征了11个TphK和10个PcaK同源转运蛋白，揭示了其底物特异性谱系，并通过构建嵌合转运蛋白证实了MFS转运蛋白核心结构域的可塑性和模块性，为芳香酸类化合物的高效生物转化提供了重要的转运蛋白工具库和工程化策略。

　　

在追求绿色生物制造的时代浪潮中，微生物细胞工厂被寄予厚望，能够将可再生资源甚至废弃物转化为高价值的化学品和材料。然而，这些看似美好的蓝图背后，却隐藏着一个长期被忽视的"卡脖子"难题——细胞膜上的物质运输。就像一座工厂即使拥有先进的生产线，如果原材料运不进去、产品运不出来，一切都将是空谈。对于微生物细胞而言，如何高效地将目标底物"请进来"，或者将有害产物"送出去"，直接决定了整个生物制造过程的效率和经济可行性。

其中，芳香酸类化合物，如来源于木质素的原儿茶酸(PCA)和来源于塑料废弃物聚乙烯 terephthalate (PET) 的对苯二甲酸(TPA)，是具有重要应用前景的原料。它们的微生物转化利用高度依赖于一类名为主要协助转运蛋白超家族(Major Facilitator Superfamily, MFS)的膜蛋白。MFS是最大且最多样的次级主动转运蛋白家族，能够利用离子梯度势能驱动各种化学物质（包括糖、有机酸、药物等）的跨膜运输。PCA和TPA的摄取就分别由MFS家族的PcaK和TphK转运蛋白负责。这些转运蛋白因其相对简单的结构（通常为400-600个氨基酸，形成12-14个跨膜螺旋）和无需ATP水解的低细胞负担，而成为微生物菌株工程化的理想靶点。

然而，对MFS转运蛋白进行研究和工程化改造却面临巨大挑战。首先，MFS成员间的序列相似性极低（通常只有12-18%），仅凭序列同源性难以预测其功能。其次，膜蛋白在脱离天然磷脂环境后极不稳定，其纯化和体外功能测定需要复杂且昂贵的技术。直接测量转运活性通常需要标记底物，成本高昂。尽管存在一些基于pH敏感染料的替代方法，但其灵敏度对于低周转率的转运蛋白往往不足。因此，大量MFS转运蛋白的功能未被表征，成为菌株开发中的一个"黑箱"。

为了突破这一瓶颈，曼彻斯特大学曼彻斯特生物技术研究所的Philip Le Roy、Micaela Chacon和Neil Dixon*研究团队在《Journal of Biological Engineering》上发表了一项创新性研究。他们另辟蹊径，利用基因编码生物传感器这一强大的合成生物学工具，建立了一套高效、高通量的MFS转运蛋白功能鉴定与表征平台。该研究的核心策略是"功能关联性"原则，即假定与PCA或TPA分解代谢操纵子相邻的MFS转运蛋白基因，很可能参与相应芳香酸的转运。基于此，研究人员展开了一场针对芳香酸MFS转运蛋白的"挖掘-表征-工程化"的探索之旅。

关键技术方法概览

本研究综合利用了生物信息学、合成生物学和蛋白工程等多种技术。首先，利用cblaster多基因同线性分析工具，以已知的TPA（使用Rhodococcus jostii RHA1的tph操作子）和PCA（使用代表2,3-和4,5-裂解途径的操作子及已验证的3,4-途径PcaK序列）分解代谢操纵子为查询序列，从NCBI基因组数据库中挖掘非冗余的TphK和PcaK同源蛋白，构建系统发育树并筛选代表不同分类群和序列多样性的候选基因。其次，将筛选出的转运蛋白基因分别克隆至含有TPA响应转录因子TphR或PCA响应转录因子PcaV的质粒中，构建转运蛋白-生物传感器复合体，并在恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida) KT2440宿主（野生型或ΔpcaK背景）中，通过检测绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的表达来定量评估转运蛋白功能及其底物特异性。最后，通过跨膜螺旋拓扑结构预测和比对，选择核心跨膜螺旋（TM1, TM4, TM7, TM10），在功能已验证的R. pyridinivorans TphK和P. putida PcaK之间进行单个或组合的螺旋结构域交换，构建嵌合转运蛋白，并利用上述生物传感器平台评估其功能变化，以探究结构-活性关系。

结果

通过同线性分析挖掘推定的TphK和PcaK同源物

研究人员采用" guilt by association "策略，利用完整的TPA或PCA分解代谢操纵子序列进行同线性分析，有效富集了可能具有目标功能的MFS转运蛋白序列。对于TphK，分析揭示了比以往认知更广的分类分布，不仅在放线菌中占主导(66%)，也出现在α-、β-和γ-变形菌纲中，表明TPA分解代谢能力在细菌中的传播范围更广。最终从9个不同细菌属中筛选出11个TphK候选者进行功能验证。对于PcaK，研究考虑了PCA分解的三种不同途径（2,3-, 3,4-, 4,5-裂解途径），共获得88个序列。系统发育分析显示，同一途径内的PcaK序列相似性较高，而不同途径间差异显著。研究最终从三条途径中选取了10个代表不同属的PcaK同源物，以评估其潜在功能差异。

通过响应性生物传感器筛选推定的MFS

将选定的TphK和PcaK基因分别克隆到含有TphR或PcaV转录因子及sfgfp报告基因的质粒中，构建转运蛋白-生物传感器系统。在恶臭假单胞菌中，通过检测不同浓度TPA或PCA诱导下的GFP荧光强度，验证转运蛋白功能。剂量反应曲线分析表明，11个TphK同源物中有8个（如来源于R. jostii, R. pyridinivorans, P. umsongensis等）对TPA有响应，但其灵敏度(EC₅₀)和最大诱导倍数存在显著差异。10个PcaK同源物中有6个（如来源于P. putida, P. aeruginosa, A. baylyi等）对PCA有功能响应，同样表现出多样的动力学特征。一个阴性对照（无转运蛋白）实验表明，在实验条件下，TPA几乎不能被动扩散进入细胞，而PCA在高浓度下有轻微背景摄取，可能与宿主内源性转运蛋白有关。

TphK和PcaK生物传感器构建体的底物依赖性激活

为探究转运蛋白的底物特异性，研究团队利用包含27个TPA类似物和28个PCA类似物的化合物库对功能性的转运蛋白-生物传感器构建体进行了筛选。TphK同源物不仅响应TPA，还对苯环2位带有羟基(T13)、溴(T15)、碘(T16)、氨基(T18)等基团的TPA衍生物，以及更长的联苯-4,4-二羧酸(T20)有响应，表明其底物识别具有一定灵活性。不同TphK同源物对特定效应物的响应强度不同，例如TphK_S.Nap对溴代TPA响应最强。PcaK同源物主要响应在3位和/或4位带有羟基、1位为羧基、甲酯、酰胺或醛基的苯甲酸衍生物。值得注意的是，来源于P. putida和B. massiliglacei的PcaK构建体独特地对5位羟基化的效应物（如3,5-二羟基苯甲酸P3和没食子酸P28）有强烈响应，这表明了其特异的底物偏好。交叉实验（将TphK_R.Pyr克隆入PcaV背景，或将PcaK_P.Put克隆入TphR背景）显示交叉反应性有限，但发现PcaK_P.Put-TphR构建体对2,5-吡啶二羧酸(T4)有微弱响应。

PcaK和TphK点突变的生物传感器筛选

为验证生物传感器平台检测蛋白工程化效果的能力，研究人员在已鉴定的P. putida PcaK中引入了三个已知影响4HBA摄取的点突变（E144A, R124A, R398A）。生物传感器检测结果显示，这些突变几乎完全废除了对PCA的摄取能力，并显著降低了对4HBA的响应，与文献报道一致，证明了该平台检测细微功能变化的灵敏度。

同源物序列比对和分析

通过对功能性TphK和PcaK序列进行跨膜螺旋拓扑预测和比对，发现形成中央空腔的核心跨膜螺旋（TM1, TM4, TM7, TM10）上的氨基酸残基差异显著，这些区域可能主导底物识别和协同转运。

核心螺旋结构域TphK嵌合生物传感器构建体的筛选

研究团队将R. pyridinivorans TphK与P. putida PcaK的核心跨膜螺旋（TM1, TM4, TM7, TM10）进行了整体交换，构建了嵌合转运蛋白TphK_{PcaK_TM1,4,7,10}-TphR和PcaK_{TphK_TM1,4,7,10}-PcaV。在TphR背景下，嵌合体失去了对TPA和联苯-4,4-二羧酸的响应，但保留了对2位取代TPA类似物（羟基、溴、碘、氨基）的部分活性，并且获得了对2,5-吡嗪二羧酸(T5)和萘-2,6-二羧酸(T21)的摄取能力。在PcaV背景下，嵌合体保留了对PCA和4HBA的部分活性，但丧失了对5位羟基化效应物（P3, P28）的响应，同时对对香豆酸(P27)的摄取能力显著增强。

单个螺旋结构域嵌合TphK和PcaK_P.Put生物传感器构建体的筛选

进一步地，研究人员将四个核心螺旋逐个进行交换，构建了15个嵌合体并进行功能筛选。单个螺旋的交换对功能的影响各异。例如，在PcaK中，TM1的交换部分保留了PCA转运活性；TM4的交换对功能影响相对较小；TM7和TM10的交换则显著影响了对5位羟基化底物的识别，但增强了对苯甲醛(P17)和4HBA(P25)的响应。在TphK中，TM4的交换是驱动对T5和T21产生新活性的主要因素；TM10的交换则显著影响了对碘代、溴代和氨基TPA的摄取，但增强了对羟基TPA的响应。结果表明，某些功能增益（如对T5, T21, P27的摄取）需要多个PcaK螺旋结构域的协同替换才能实现，暗示了螺旋间的相互依赖关系对于完整功能的重要性。

结论与讨论

本研究成功开发并验证了一种基于基因编码生物传感器的高通量平台，用于MFS转运蛋白的挖掘、表征和工程化改造。通过同线性分析富集的候选库，结合功能筛选，研究者鉴定出多个新型且功能多样的PcaK和TphK同源转运蛋白，扩展了我们对这些芳香酸转运蛋白系统发育分布和底物特异性的认知。尤为重要的是，通过构建嵌合转运蛋白，研究揭示了MFS转运蛋白核心跨膜螺旋结构域在底物识别中的关键作用及其可塑性与模块性。单个或组合螺旋的替换不仅能导致功能丧失或减弱，还能产生新的底物特异性（增益功能），这为理性设计具有期望底物范围的转运蛋白提供了宝贵见解和可行性证明。

尽管该方法受限于生物传感器本身的识别谱，但其高通量、易操作及高灵敏度等优势，使其成为克服膜蛋白研究传统难题的强大工具。本研究提供的经过验证的TphK和PcaK同源物库、详细的底物特异性谱系以及初步的蛋白工程探索，为将来将转运工程整合到微生物细胞工厂开发流程中，以实现对芳香酸类化合物（尤其是来源于木质素和塑料废弃物的）的高效生物转化，奠定了坚实的基础，推动了绿色生物制造的发展。