脊髓神经网络组织与肌细胞共培养系统揭示不同肌细胞对出生后脊髓发育的差异性调控作用

《Cellular and Molecular Life Sciences》：Neural network tissue and myocytes co-culture system reveals effects of different myocytes on postnatal development of spinal cord neural network

本研究针对出生后脊髓神经网络与肌细胞相互作用机制不清的问题，构建了脊髓神经网络组织(SC-NNT)与骨骼肌细胞(SkMCs)/海绵体平滑肌细胞(CC-SmMCs)共培养系统。研究发现两种肌细胞均能促进SC-NSCs向神经元分化而非神经胶质细胞，且CC-SmMCs更强促进DβH+神经元分化，SkMCs则更有效促进轴突延伸和神经肌肉接头样结构形成。该模型7天内即可实现神经网络对肌收缩的调控，为出生后神经肌肉疾病模型构建和组织工程神经移植提供了新技术平台。

　　

在生命科学领域，脊髓作为连接大脑与全身器官的桥梁，其神经网络与肌细胞的相互作用对神经系统发育成熟至关重要。然而长期以来，科学家们对出生后哺乳动物脊髓神经网络与不同肌细胞（如骨骼肌和平滑肌）之间的相互作用机制知之甚少。传统研究多依赖于胚胎观察，无法进行遗传干预或疾病建模；而近年来兴起的iPSC衍生神经肌肉类器官虽避免胚胎伦理问题，但仍存在构建周期长（超过30天）、成本高、标准化难等瓶颈。

针对这一难题，来自中山大学的研究团队在《Cellular and Molecular Life Sciences》发表了创新性研究成果。他们巧妙利用新生大鼠脊髓神经干细胞(SC-NSCs)，通过组织工程技术构建三维脊髓神经网络组织(SC-NNT)，分别与骨骼肌细胞(SkMCs)和海绵体平滑肌细胞(CC-SmMCs)共培养，系统揭示了两种肌细胞对出生后SC-NSCs分化和SC-NNT形成的差异化调控机制。

研究团队运用细胞培养与鉴定、免疫荧光染色、mRNA测序、光遗传学刺激等关键技术方法，其中SC-NSCs来源于3日龄SD大鼠或转基因小鼠，CC-SmMCs取自4周龄雄性大鼠，SkMCs来源于7日龄野生型或GFP转基因SD大鼠。

共培养系统的构建

研究人员首先成功培养并鉴定了SC-NSCs（Nestin⁺和HoxD9⁺）、CC-SmMCs（α-SMA⁺）和SkMCs（MyoG⁺）。将SC-NSCs接种至3D胶原海绵支架形成SC-NNT，分别与两种肌细胞共培养7天建立NN-SmM组（CC-SmMCs共培养）和NN-SkM组（SkMCs共培养），以单独培养的SC-NNT作为对照（NN组）。细胞活性检测证实所有细胞均保持高活力。

肌细胞共培养促进SC-NSCs向神经元分化

免疫荧光显示，与NN组（31.04%±10.05%）相比，NN-SmM组（48.33%±6.81%）和NN-SkM组（54.63%±5.79%）的Map2⁺神经元比例显著增加，而GFAP⁺星形胶质细胞和Olig2⁺少突胶质细胞比例降低。RNA-Seq聚类热图分析进一步证实，两组共培养体系中神经元分化相关基因表达上调，而神经胶质细胞分化相关基因表达下调。

肌细胞共促进兴奋性神经元分化

神经递质表达分析发现，与NN组相比，NN-SmM组和NN-SkM组的ChAT⁺、DβH⁺和VGluT1⁺兴奋性神经元比例均增加，其中NN-SmM组的DβH⁺神经元数量显著高于NN-SkM组。相反，GAD67⁺抑制性神经元比例在共培养组中降低。KEGG分析表明，Ras、PI3K-Akt、cGMP-PKG等信号通路在共培养体系中均被激活，而NN-SmM组中Wnt、TGF-β、Rap1通路特异性上调，NN-SkM组中甲状腺激素、ErbB等通路显著上调。

共培养对突触形成和轴突生长的促进作用

NN-SmM组和NN-SkM组的突触蛋白SYP和PSD95表达均显著高于NN组。在NN-SmM组中，NF⁺轴突与α-SMA⁺的CC-SmMCs建立连接；而在NN-SkM组中，NF与α-银环蛇毒素(BTX)共定位表明形成了神经肌肉接头样结构。光遗传学和谷氨酸刺激实验证实，SC-NNT在共培养7天后即可控制SkMCs收缩，且该效应可被TTX和MK-801阻断。值得注意的是，NN-SkM组的神经元轴突长度（74.88±17.34μm）显著大于NN-SmM组（36.28±11.65μm）。

这项研究通过创新性的共培养系统，揭示了SkMCs和CC-SmMCs对出生后脊髓神经网络发育的差异化调控机制。与需要30天以上培养的iPSC衍生类器官相比，该模型在7天内即可实现神经网络对肌肉收缩的功能性控制，为研究出生后神经肌肉疾病提供了更高效、更贴近生理状态的平台。此外，该系统包含兴奋性和抑制性神经元以及神经胶质细胞，比单纯由神经元组成的神经肌肉类器官更能模拟体内真实环境。研究还提示，与肌细胞共培养获得的兴奋性SC-NNT在脊髓损伤修复移植中具有潜在应用价值，可能更有利于与脑源性神经纤维形成突触连接，重建大脑对肌肉的控制功能。该成果不仅为出生后神经肌肉疾病模型构建和药物筛选提供了新技术，也为组织工程神经移植物的开发指明了新方向。