ROCK1/MLC/NMMHC IIA-肌动蛋白信号轴在缺血性脑卒中血脑屏障破坏中的正反馈调控机制及治疗意义

《Cellular and Molecular Life Sciences》：The role of ROCK1/MLC/NMMHC IIA-actin signaling in ischemic stroke-induced blood-brain barrier disruption: implications for therapeutic intervention

本研究针对缺血性脑卒中(IS)后血脑屏障(BBB)破坏的临床难题，通过构建内皮特异性Myh9ECKD/Myh9iECKI基因修饰小鼠和OGD/R细胞模型，首次揭示ROCK1/MLC/NMMHC IIA-肌动蛋白信号环路形成正反馈放大机制，证实采用Y-27632、blebbistatin和cytochalasin D分别靶向该通路关键节点可显著减轻脑I/R损伤，为IS治疗提供新策略。

　　

当脑部的血液供应突然中断，缺血性脑卒中（Ischemic Stroke, IS）便会发生，这种疾病在全球范围内是导致残疾和死亡的主要原因之一。目前临床上的rt-PA溶栓和机械取栓等治疗方法，受限于狭窄的治疗时间窗（仅4-5小时），并且常常会引发脑缺血再灌注（Ischemia-Reperfusion, I/R）损伤，反而加重脑组织损害，导致仅有不到3%的患者能从中获益。因此，寻找新的治疗靶点和药物迫在眉睫。

在脑卒中的复杂病理机制中，血脑屏障（Blood-Brain Barrier, BBB）的破坏是加剧脑I/R损伤的关键环节，它会引发炎症、新生血管形成、细胞凋亡和坏死等一系列连锁反应。因此，在缺血病理过程中保护BBB的完整性至关重要。早期研究指出，BBB的破坏与内皮细胞骨架的重排密切相关。非肌肌球蛋白重链IIA（Non-muscle Myosin Heavy Chain IIA, NMMHC IIA）与肌动蛋白（actin）的相互作用，以及ROCK/MLC通路，是驱动细胞骨架重组的核心。之前的研究发现，Caspase-3/ROCK1/MLC/NMMHC IIA-肌动蛋白正反馈环路介导了过氧化氢诱导的神经元凋亡，但该环路在脑I/R损伤和BBB破坏中的作用尚不清楚。

为了探究这一问题，研究人员开展了一项深入的研究，论文发表在《Cellular and Molecular Life Sciences》上。他们利用内皮特异性NMMHC IIA条件性敲除（Myh9^ECKD）小鼠、NMMHC IIA诱导性内皮条件性敲入（Myh9^iECKI）小鼠以及C57BL/6J野生型小鼠，构建了大脑中动脉闭塞/再灌注（Middle Cerebral Artery Occlusion/Reperfusion, MCAO/R）模型模拟脑卒中。在体外，则采用脑微血管内皮细胞（包括原代细胞pBMECs和bEnd.3细胞系）建立氧糖剥夺/再灌注（Oxygen-Glucose Deprivation/Reoxygenation, OGD/R）模型。研究人员评估了NMMHC IIA抑制剂blebbistatin、ROCK1抑制剂Y-27632和肌动蛋白解聚剂cytochalasin D对I/R诱导的ROCK/MLC/NMMHC IIA-肌动蛋白通路激活、紧密连接蛋白（Tight Junction Proteins, TJs）降解以及脑损伤的影响。

研究主要应用了以下几种关键技术方法：通过小鼠MCAO/R手术和细胞OGD/R处理模拟脑缺血再灌注损伤；利用TTC染色评估脑梗死体积，Evans Blue（EB）和FITC-葡聚糖渗透实验评估BBB通透性；通过蛋白质印迹（Western blot）、免疫共沉淀（Co-IP）和免疫荧光技术分析信号通路蛋白表达、相互作用及细胞定位；采用神经功能缺损评分进行行为学评估；并运用内皮细胞特异性基因敲除和敲入小鼠模型（源自南京大学模型动物研究所）进行在体功能验证。

Myh9^ECKD抑制MCAO/R诱导的ROCK/MLC/NMMHC IIA-肌动蛋白通路激活

研究结果显示，与I/R组相比，Myh9^ECKD显著改善了神经功能，减少了脑梗死体积，降低了EB泄漏，并保护了ZO-1、occludin和Claudin-5等紧密连接蛋白的降解，表明BBB破坏得到缓解。在分子水平上，I/R显著降低了ROCK1的表达，增加了MLC的磷酸化（p-MLC），而Myh9^ECKD和blebbistatin处理则逆转了这些变化，抑制了ROCK/MLC通路的激活。

Myh9^ECKD抑制OGD/R诱导的ROCK/MLC/NMMHC IIA-肌动蛋白通路激活

在体外pBMECs实验中，OGD/R同样增加了p-MLC并降低了ROCK1表达，Myh9^ECKD则抑制了这些效应。免疫共沉淀实验进一步证实，OGD/R增强了NMMHC IIA与F-actin的相互作用，而Myh9^ECKD和blebbistatin抑制了这种相互作用，从而减轻了actomyosin收缩性。同时，这些干预措施也减轻了OGD/R引起的ZO-1和occludin降解。

Myh9^iECKI加剧缺血性脑卒中后的BBB渗漏

为了验证NMMHC IIA过表达的影响，研究人员构建了Myh9^iECKI小鼠。结果显示，与I/R组相比，Myh9^iECKI进一步恶化了脑梗死体积和神经功能缺损，增加了EB泄漏，并加剧了TJs的降解。

Myh9^iECKI加剧MCAO/R诱导的ROCK/MLC/NMMHC IIA-肌动蛋白通路激活

在Myh9^iECKI小鼠中，MCAO/R进一步抑制了ROCK1表达，增加了NMMHC IIA表达和p-MLC水平，表明NMMHC IIA过表达放大了ROCK/MLC通路的激活。

ROCK1抑制剂Y-27632改善缺血性脑卒中后的BBB渗漏

体内实验表明，在缺血后给予Y-27632，能显著减少脑梗死体积，改善神经功能，降低EB和FITC-葡聚糖泄漏，并保护ZO-1、occludin和Claudin-5的表达。

Y-27632抑制MCAO/R诱导的ROCK/MLC/NMMHC IIA-肌动蛋白通路激活

分子机制研究表明，Y-27632抑制了MCAO/R引起的NMMHC IIA上调和MLC磷酸化，并阻止了ROCK1的下调。在bEnd.3细胞中，Y-27632也抑制了OGD/R诱导的ROCK/MLC通路激活和NMMHC IIA与F-actin的相互作用。

Cytochalasin D抑制OGD/R诱导的ROCK/MLC/NMMHC IIA-肌动蛋白通路激活

使用肌动蛋白解聚剂cytochalasin D处理bEnd.3细胞，发现其能显著降低NMMHC IIA的表达，抑制MLC磷酸化和ROCK1活性，减少NMMHC IIA与F-actin的相互作用，并防止ZO-1和occludin的降解。

本研究通过多层次的实验证据，揭示了ROCK1/MLC/NMMHC IIA-肌动蛋白信号轴在脑I/R诱导的BBB破坏中发挥着核心作用，并且该通路作为一个正反馈环路运作。I/R后，ROCK/MLC通路的激活增强了肌动蛋白-肌球蛋白的相互作用，形成应力纤维，拉伸细胞骨架，破坏内皮细胞间的紧密连接，增加BBB通透性。抑制该环路的任一关键节点——无论是用Y-27632抑制ROCK1，用blebbistatin抑制NMMHC IIA，用cytochalasin D解聚肌动蛋白，还是通过基因手段敲低NMMHC IIA——都能有效抑制通路激活，减轻BBB损伤和脑I/R损伤。相反，内皮细胞过表达NMMHC IIA则会进一步加剧BBB破坏并放大ROCK/MLC通路的激活。

这项研究的结论具有重要意义。它不仅阐明了脑卒中后BBB破坏的一个新的分子机制，即ROCK/MLC/NMMHC IIA-肌动蛋白正反馈环路，而且验证了靶向该环路多个节点的治疗策略的有效性。这为开发治疗缺血性脑卒中和BBB相关疾病（如脑出血、帕金森病、阿尔茨海默病等）的新药提供了有希望的靶点和思路。未来的研究可以进一步探索其他BBB相关细胞（如星形胶质细胞、周细胞）在该环路中的作用，以及多器官内皮细胞之间的潜在交互对话，从而更全面地理解NMMHC IIA在BBB功能调控中的复杂网络。