综述：溶血曼氏杆菌的诊断技术探索：方法、应用与前景

《Frontiers in Microbiology》：Exploring the diagnostic landscape of Mannheimia haemolytica: technologies, applications, and perspectives

本综述系统评述了溶血曼氏杆菌（Mannheimia haemolytica）的诊断技术进展，涵盖了传统培养、分子诊断（PCR、qPCR、LAMP、RPA、iiPCR）、免疫学方法（ELISA、免疫组化）及质谱技术（MALDI-TOF MS）。文章重点分析了各技术的灵敏度、特异性、时效性及适用场景，指出分子技术显著提升了检测效率，而质谱技术为分型鉴定提供了新工具。作者强调需根据临床需求、资源条件选择诊断路径，并展望了纳米技术、微流控、CRISPR-Cas及人工智能在下一代诊断开发中的潜力。

　　

2 血清学诊断技术

传统免疫学方法长期以来被用于牛呼吸道疾病（BRD）的诊断，主要聚焦于病原特异性抗体或抗原的检测。这些技术基于抗原-抗体相互作用原理，可通过宿主的免疫反应识别感染。此类方法以操作简单、特异性高见长，适用于大规模筛查和现场诊断。

早期研究曾建立平板凝集试验用于溶血曼氏杆菌的血清分型，可在10秒内检测牛源和羊源菌株，但其灵敏度较低且需预制备特异性血清。随后发展的酶联免疫吸附试验（ELISA）方法能够检测疫苗接种后牛、羊支气管肺泡灌洗液和血清中的特异性抗体，最低检测稀释度可达1/1024，实现了大量样本的快速筛查。研究还发现，血清中IgG1、IgG2和IgM水平较高，而支气管肺泡灌洗液中则以IgG1、IgG2和IgA为主。

利用高免血清制备的凝集素试剂可快速检测肺组织中的活菌或死菌，能鉴定94%的野生型菌株血清型，尽管存在轻微交叉反应和自身凝集，仍保持了较高的特异性。此外，采用链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物的免疫过氧化物酶染色法，可成功定位绵羊肺组织切片中的溶血曼氏杆菌抗原，其主要分布于中性粒细胞内，虽然在细菌载量低时可能出现假阴性，但在不同肺区病变定位方面表现优异。

近年来，免疫组织化学染色在阐明溶血曼氏杆菌在疾病发生中的空间分布和组织嗜性方面展现出重要价值。有研究在自然感染牛呼吸道合胞病毒（BRSV）的肺炎病例中，观察到溶血曼氏杆菌广泛分布于肺泡上皮、支气管和细支气管，提示BRSV感染可能促进并发溶血曼氏杆菌感染。新近开发的间接ELISA方法使用全细胞抗原检测BRD中针对溶血曼氏杆菌的IgG、IgM和IgA抗体，可在3小时内完成检测，灵敏度达90%，特异性超过80%。但需注意，高水平的特异性抗体可能反映的是保护状态而非活动性疾病，强调需要结合其他诊断方法进行确诊。

总之，传统免疫学方法对于大规模筛查和初步现场诊断至关重要，但其灵敏度受样本质量和检测条件等因素影响，常需与分子生物学技术联用，以弥补局限性，显著提升检测灵敏度和准确性，从而为BRD的综合诊断和有效疾病管理提供坚实技术基础。

3 分子诊断技术

自20世纪80年代末引入以来，聚合酶链式反应（PCR）技术彻底改变了分子诊断领域，已成为病原检测和疾病管理的基石工具。随后几十年间，多重PCR、实时定量PCR（RT-qPCR）、环介导等温扩增（LAMP）、重组酶聚合酶扩增（RPA）和绝缘等温PCR（iiPCR）等先进分子技术的出现，显著提升了诊断的灵敏度、特异性和速度。这些创新极大地改善了溶血曼氏杆菌等呼吸道病原的检测性能，实现了更快、更准确的诊断。多样化分子平台的整合，将诊断能力扩展至常规实验室之外，支持便携式、床旁检测系统的开发，为及时干预和有效疾病控制提供了关键支持。

溶血曼氏杆菌利用一系列毒力因子完成宿主定植、免疫逃逸和组织损伤。其致病潜力的核心是白细胞毒素操纵子（lktCABD），它编码一种高效的RTX毒素家族成员，可特异性靶向反刍动物白细胞，在疾病发生中起关键作用。此外，如溶血曼氏杆菌血清型1特异性抗原（PHSSA）和Rpt2等基因已被确定为血清型特异性标志物，有助于精确区分菌株。超氧化物歧化酶A（sodA）基因在溶血曼氏杆菌分离株中高度保守，是可靠的物种特异性分子标志。此外，黏附素相关基因（包括黏附素假基因B1和黏附素G）与基因型水平变异相关，揭示了该物种的遗传多样性。这些遗传决定因子不仅阐明了溶血曼氏杆菌致病的分子基础，也是开发灵敏、特异性分子诊断方法的关键靶标，从而提升了临床病原检测的精确度。

3.1 PCR和多重PCR

早期的单重PCR实现了溶血曼氏杆菌的快速、精确检测。针对tRNA基因间隔区的PCR assay可在2小时内区分巴斯德菌属和曼氏杆菌属，为后续分子进展奠定了基础。针对gcp基因的PCR assay可直接从死亡绵羊的肺组织中检测病原体，即使在培养阴性的病例中，该方法的PCR阳性率也达到77%，进一步证实了靶基因选择对检测灵敏度和准确性的决定性作用。在羊乳腺炎诊断中，结合LktA、rpoB和rrnA基因扩增与系统发育分析，可在约3小时内确认分离株。

为满足对通量和效率的更高要求，采用了多重PCR技术。针对HP、Lkt、Lkt2和16S rRNA的 assays，使用低至10 ng的DNA可在约1.5小时内区分溶血曼氏杆菌、葡萄糖曼氏杆菌和瘤胃曼氏杆菌。通过靶向PHSSA和Rpt2基因并引入绵羊线粒体12S rRNA作为内参，扩展了该策略，提高了准确性和可靠性。在BRDC背景下，针对KMT1（多杀性巴斯德菌）、artJ-lktC（溶血曼氏杆菌）和plo（化脓性真杆菌）的多重PCR，在1.5小时内达到了40 pg/μL的低检测限。同时，开发的多重PCR assay能够同时检测六种禽呼吸道病原体，虽然四个靶标在多重形式下可可靠检测，但溶血曼氏杆菌和多杀性巴斯德菌仍需要单重PCR。此外，观察到靶向Lkt比靶向ssa具有更高的特异性，强调了靶基因选择在诊断 assay 开发中的关键作用。针对野生反刍动物的诊断复杂性，开发了一个整合培养非依赖平台，结合多重PCR、扩增子测序和生物信息学。通过lktA和16S rRNA分析同时检测溶血曼氏杆菌、特氏杆菌、多杀性巴斯德菌和羊支原体，即使涉及38对引物的复杂流程，也能实现多位点序列分型和高分辨率数据解读。

总之，单重和多重PCR方法的进步显著缩短了诊断时间（从约2小时缩短至1.5-3小时），同时提高了灵敏度（检测限低至40 pg/μL）和特异性。测序和多位点分析的整合进一步扩展了诊断精度，形成了从快速筛查到确定性鉴定的无缝衔接，克服了传统培养诊断的局限性，增强了临床和流行病学效用。

3.2 实时定量PCR

实时定量PCR（RT-qPCR）因其高灵敏度、高特异性和快速周转时间，已成为病原检测和鉴定的基石。与常规PCR不同，RT-qPCR不仅提供实时定量结果以帮助准确评估病原体载量，而且能为临床治疗支持提供更快的反馈。对于溶血曼氏杆菌，RT-qPCR方法不断改进，现已应用于监测家禽、牛和其他动物的疾病。

针对sodA基因保守区的RT-qPCR assay，可在5小时内快速、特异性地鉴定五种曼氏杆菌属物种（溶血曼氏杆菌、变异曼氏杆菌、瘤胃曼氏杆菌、颗粒曼氏杆菌和葡萄糖曼氏杆菌），检测灵敏度约为每克肺组织10³个细菌细胞。研究结果凸显了sodA基因相较于高度保守的16S rRNA基因具有更强的区分能力，强调了其作为曼氏杆菌属内种间区分的有力分子标志物的效用。在先前进展的基础上，开发了多重RT-qPCR平台——RespoCheck PCR，专门用于同时检测四种主要BRD病原体：多杀性巴斯德菌、溶血曼氏杆菌、睡眠嗜组织菌和化脓性真杆菌，使用支气管肺泡灌洗液作为诊断样本。该 assay 显示出卓越的分析灵敏度，每反应可检测低至1-10 fg的纯化DNA，诊断特异性达到98.3%。值得注意的是，在约30分钟内即可完成对16S rDNA中溶血曼氏杆菌V3区的检测，凸显了该 assay 作为早期BRD诊断快速可靠工具的潜力。此外，建立了采用水解探针的多重RT-qPCR assay，并在Peltier和旋转热循环仪平台上验证了其在检测BRDC关键病原体中的应用。该 assay 特异性靶向白细胞毒素操纵子（lktCABD）内的四个连续基因，实现了稳健的病原体鉴定。在不同平台上观察到可比的诊断性能，Peltier系统的灵敏度为80.5%，特异性为88.8%；旋转系统的灵敏度为80.1%，特异性为88.3%。该 assay 的检测限为每反应1.2至12 CFU，相较于其他可比方法，在分析灵敏度和诊断效率方面有显著提高。另外，引入了集成的、单次运行的RT-qPCR系统，用于全面检测与BRDC相关的16种病原体，包括10种病毒和6种细菌病原。通过特异性靶向溶血曼氏杆菌高度保守的sodA基因，该 assay 可在不到1小时的诊断时间内实现对该病原体的高特异性鉴定，检测限低至每反应1 CFU。通过靶向保守遗传区域并最小化 assay 持续时间，样品降解风险显著降低，从而显著提高了诊断灵敏度和特异性。

总体而言，RT-qPCR技术从单靶标 assays 到多平台集成系统的发展，导致检测时间（低至0.5小时）和更低检测限（从每克10³个细菌细胞到低至每反应1 CFU）的显著改善。尽管每种方法都有其特定侧重点，但它们共同构成了一个高效、精确和灵敏的诊断系统，不仅弥补了单重PCR和多重PCR方法的局限性，而且为呼吸道疾病的早期诊断和临床治疗提供了强有力的技术支持。

3.3 环介导等温扩增

环介导等温扩增（LAMP）为溶血曼氏杆菌的床旁检测提供了一种极具前景的分子诊断方法。其检测限可达每反应约一个拷贝。所描述的LAMP assays 灵敏度在66.7%至100%之间，特异性在95%至100%之间，同时在等温条件下保持了异常简单的操作性。与常规PCR不同，LAMP不依赖复杂的热循环设备，使其特别适合在资源有限的环境中进行快速现场诊断。近年来，LAMP assays 在检测BRDC相关病原体方面受到越来越多的关注，为快速、可靠的临床诊断提供了一种稳健、耐抑制的替代方案。

针对三种主要BRD病原体——溶血曼氏杆菌、多杀性巴斯德菌和睡眠嗜组织菌——开发了LAMP assay。他们设计了三组引物靶向溶血曼氏杆菌的rsmL、rsmC和lktA基因，经过一系列实验优化，确定了最佳引物组合，可在45分钟内完成检测。该 assay 在水样中的检测限为10³拷贝/反应，在液体Amies样品中为10⁴拷贝/反应，展示了操作简单和结果判读直观的优点，使其非常适合于快速现场诊断。在此基础上，进一步开发了用于检测BRD中多杀性巴斯德菌、溶血曼氏杆菌和睡眠嗜组织菌的LAMP方法。通过使用预配制的比色预混料结合仪器检测，该方法实现了高分析灵敏度和特异性，可在60分钟内进行清晰的视觉检测，检测限达到312拷贝/反应。然而，该 assay 在检测溶血曼氏杆菌方面表现不佳，由于与非靶标DNA的交叉反应而观察到假阴性。这一结果强调，靶基因的选择和引物的筛选仍是未来研究必须解决的关键挑战。此外，通过建立能够区分与BRDC相关的溶血曼氏杆菌基因1型（基因型1）和基因2型（基因型2）菌株的基因型鉴别 assay，进一步优化了LAMP技术。他们选择黏附素假基因B1作为基因型1的靶标，黏附素G作为基因型2的靶标，并设计了高特异性的LAMP引物，可在1小时内实现检测。该 assay 的检测限在每反应1到100拷贝之间，并有效避免了与巴斯德菌科其他成员的交叉反应。此外，他们的研究指出，Mohan等人使用的靶向rsmL基因的LAMP引物特异性不足，进一步强调了精确靶标选择和引物设计在临床应用中的重要性。

总之，这些研究强调了LAMP技术在检测BRD病原体方面的巨大潜力。检测时间在45至60分钟之间，灵敏度从每反应10³拷贝低至每反应1拷贝，这些方法正在不断优化，并作为补充诊断工具。除了适用于现场的精确诊断外，这些方法还为提高临床灵敏度、减少诊断错误和解析菌株特异性致病性提供了路线图。

3.4 集成/新型PCR方法

分子生物学技术的不断突破催生了许多创新性PCR方法的快速出现，极大地扩展了BRD感染的检测途径和流程。常规PCR技术以其卓越的灵敏度和特异性而闻名，能有效识别单一感染。然而，在处理同时存在多种病原体的复杂样本时，通常需要进行多次检测，导致过程耗时费力。为解决这一问题，研究人员一直在探索将多重PCR与其他分子诊断技术相结合的新方法。这些方法可在单次反应中同时鉴定多种病原体，同时显著缩短检测时间、提高灵敏度，并减少对复杂仪器的依赖，从而在现场诊断中展现出潜在应用价值。

将多重PCR技术与DNA微阵列相结合，可同时检测四种细菌病原体（溶血曼氏杆菌、睡眠嗜组织菌、多杀性巴斯德菌、牛支原体）和五种病毒病原体（如牛副流感病毒3型、牛呼吸道合胞病毒等）。检测可在2小时内完成，检测限低至1-10拷贝，显示出高灵敏度和特异性。重组酶聚合酶扩增（RPA）可在恒定的低温（37–42?°C）下实现快速、超灵敏检测，使用最少的设备在10-20分钟内即可扩增少至1-10个靶标DNA拷贝，使其特别适合现场或床旁诊断。设计并验证了11种RPA检测方法，最终开发出一种适用于同时检测四种BRD病原体（溶血曼氏杆菌、多杀性巴斯德菌、睡眠嗜组织菌、牛支原体）、抗菌素耐药性基因（AMR）和整合接合元件（ICE）的方案。靶向溶血曼氏杆菌血清型A1和A6的nm