综述：调节性T细胞疗法：从患者数据到生物学见解

《Frontiers in Immunology》：Regulatory T cell therapies: from patient data to biological insights

这篇综述系统阐述了调节性T细胞（Treg）疗法的最新进展，重点介绍了从多克隆Treg到抗原特异性、TCR工程化和CAR工程化Treg等不同技术路线（涵盖CAR-T、TCR-T等），并详细评述了单细胞多组学（scRNA-seq、scATAC-seq）、表观遗传分析和空间转录组学等先进免疫监测技术在评估Treg持久性、功能及谱系稳定性中的应用，为优化Treg作为“活药物”治疗自身免疫病、移植物抗宿主病（GvHD）和器官移植排斥提供了重要框架。

　　

1 引言

调节性T细胞（Tregs）是CD4⁺ T淋巴细胞的一个特殊亚群，对维持免疫稳态和预防自身免疫至关重要。它们最初通过高表达CD25（IL-2受体α链）和转录因子FOXP3而被鉴定。Tregs在抑制过度免疫反应和促进对自身抗原的耐受方面发挥着核心作用。尽管在癌症中其免疫抑制功能是有害的，但这一特性使其成为治疗自身免疫性和炎症性疾病、移植物抗宿主病（GvHD）和实体器官移植的细胞疗法的有吸引力的候选者。最近来自过继性T细胞疗法试验的临床观察强调了揭示治疗结果相关性和理解癌症T细胞疗法失败机制的潜力。值得注意的是，在CD19-CAR T细胞疗法治疗大B细胞淋巴瘤中，表达嵌合抗原受体（CAR）的Tregs被确定为患者预后的负面相关因素，这为如何在临床环境中监测工程化Tregs提供了见解，并提供了工程化Tregs在人体内功能的证据。本综述审视了Treg细胞疗法临床试验的演变格局，从非工程化的多克隆Tregs到抗原特异性、T细胞受体（TCR）工程化和CAR工程化的Tregs。我们讨论了用于追踪和表征患者体内Tregs的尖端技术，并强调了从临床试验中最大化获取见解的操作考量。通过借鉴其他过继性转移方法的经验，我们旨在提供一个优化Treg疗法并扩展其临床应用的框架。

2 临床中的Treg细胞疗法

2.1 多克隆Tregs

Treg疗法最早的临床应用采用了从外周血中分离的非工程化、多克隆Tregs。这些方法通常涉及通过荧光激活细胞分选（FACS）和/或基于磁珠的方法（通常是用于CD25⁺分选的CliniMACS Plus系统）分离CD4⁺CD127^low T细胞，然后进行冷冻保存或直接给药。CliniMACS磁珠富集方法虽然实用，但通常产生约80%的Tregs与其他细胞类型的混合物。考虑到Tregs在外周血中非常罕见——仅占CD4⁺ T细胞的5-10%——该领域寻求额外的Treg临床来源以改善纯度。体外扩增方法被开发并在临床试验中实施，特别是在高剂量白细胞介素-2（IL-2）单独存在或与雷帕霉素（mTOR抑制剂）联合存在下进行抗CD3/CD28刺激，使Treg纯度提高至约90%。临床试验中还使用了其他Treg来源，例如冷冻保存的脐带血或来自儿科心脏移植的废弃胸腺组织。多克隆Tregs在GvHD预防和实体器官移植等同种异体环境中显示出良好的安全性，在1型糖尿病（T1D）等自体环境中也是如此。多克隆非工程化Treg疗法的一个重要例子是Orca-T，其中同种异体（移植物匹配的）Tregs以1:1的比例与常规T细胞（Tconv）以及CD34⁺造血干细胞一起新鲜输注以预防GvHD，并取得了积极的2期试验结果。

抗原特异性Tregs可以通过体外扩增从纯化的多克隆Tregs中富集。在同种异体环境中，宿主Tregs可以被分离，然后在体外暴露于供体细胞以扩增供体同种抗原反应性Tregs。这种方法已被用于临床试验以防止肾或肝移植排斥。富集的抗原特异性Tregs也应用于自体环境。在一项针对阿尔茨海默病（AD）的试验中，Tregs在含有β淀粉样蛋白抗原的条件下进行体外扩增，以富集对β淀粉样蛋白有反应性的Tregs。这种方法的一个有趣扩展是Cellenkos公司的“CRANE”技术，该技术从脐带血中扩增Tregs，同时富集具有高水平特定归巢受体的特定群体。

尽管体外多克隆Treg扩增方法面临一些局限性，但多克隆Tregs的早期临床经验为剂量、安全性和监测策略提供了宝贵的见解。尽管存在抗原特异性受限、可能的体内不稳定性、可变纯度和有限持久性等局限性，多克隆Treg试验已进入后期试验阶段。总之，多克隆Tregs的试验通过扩展Treg来源、改进细胞分离和扩增技术、确立抗原特异性的重要性以及在自体和非同体环境中提供初步临床获益证据，为下一代Treg疗法铺平了道路。

2.2 转化型Tregs

到2025年，多克隆T细胞产品的策略包括将常规T细胞（Tconv）重编程以获得调节功能，产生诱导性Treg（iTreg）或转化型Treg细胞。通常，临床试验中通过将CD4⁺CD25^– T细胞与IL-2、雷帕霉素、转化生长因子β（TGF-β）和负载抗CD3单克隆抗体的人工抗原呈递细胞一起培养，来生成具有强效抑制功能的FOXP3⁺ iTregs。类似的利用雷帕霉素的方案已被用于在ALS和COVID-19相关急性呼吸窘迫综合征背景下重编程Tconv细胞。例如，NCT06169176、NCT04220190和NCT04482699使用Rapa-501，这是一个两步、7天的培养过程。首先，用雷帕霉素和培养基饥饿处理使T细胞去分化，驱使T细胞朝向T干细胞记忆表型。最后一步是用IL-2、IL-4和TGF-β将T细胞重新分化为Treg和Th2程序。截至2025年，使用这种雷帕霉素重编程方法的NCT04220190是转化型Treg类别中进展最快的临床试验，处于治疗ALS的3期阶段。转化型Treg产品的细胞工程方法已开始临床试验，其中通过慢病毒转导CD4⁺ T细胞诱导高FOXP3表达，同时转入表面标志物基因tNGFR。这种自体转化的Treg样细胞产品（CD4^LVFOXP3)被用于治疗基因上缺乏功能性Tregs的患者的首次人体试验，适应症包括IPEX综合征。在类似的基因转移方法中，通过慢病毒转导将高IL-10产量诱导到CD4⁺ T细胞中（CD4^LV-IL10)以产生同种异体1型调节性T细胞（Tr1细胞），用于Tr1X Bio公司领导的GvHD和炎症性肠病（IBD）治疗的“现货型”临床试验。1型Tregs对外周耐受很重要，其抑制功能由IL-10、TGF-β和CTLA4介导，不依赖于FOXP3。这些方法仍然产生多克隆Treg样细胞，与扩增的多克隆Tregs的不同之处在于，它们在分化/扩增之前不富集Tregs，而是利用所有CD4⁺ T细胞作为起始材料，克服了获得足够Treg数量和纯度的问题。转化型Tregs在无法获得足够数量的功能性Tregs作为起始材料（例如IPEX）或炎症自然由iTreg或Tr1细胞控制（例如IBD）的情况下特别有价值，其他适应症正在研究中。

2.3 TCR工程化Tregs

Tregs的T细胞受体（TCR）工程化使其对特定疾病靶点具有抗原特异性，这是一种新兴方法，尚未完全过渡到临床。移植耐受的临床前模型表明，与多克隆Treg群体相比，TCR工程化Tregs表现出增强的效力，并且可以介导对同一微环境中存在的其他抗原反应的“关联抑制”。为了增强抗原特异性并可能提高治疗效果，该领域正在开发TCR工程化Tregs。通过引入针对相关疾病抗原（例如，移植中的同种抗原或自身免疫中的自身抗原）的TCRs，TCR工程化Tregs有望在致病部位发挥靶向免疫抑制作用。在自身免疫背景下，TCR工程化Tregs的临床前模型包括以下靶点：（i）多发性硬化症中的髓鞘碱性蛋白，（ii）狼疮性肾炎中的Smith自身抗原，（iii）血友病A中的因子VIII，（iv）抗肾小球基底膜疾病中的IV型胶原，以及（v）1型糖尿病中的谷氨酸脱羧酶。这些研究证明了TCR工程化Tregs在恢复免疫耐受方面的潜力。TCR工程化Tregs的关键潜在优势（如果成功的话）包括通过更低细胞剂量即可达到的改善的定位、增强的持久性、优异的抗原特异性以及通过减少旁观者抑制来降低非预期免疫抑制的风险。然而，在选择最佳靶抗原（对于大多数自身免疫病而言仍 largely unknown）、管理潜在的脱靶效应和遗传毒性，以及确保这些更复杂细胞产品的可靠和安全制造方面仍然存在挑战。截至2025年底，只有两项针对TCR工程化Tregs的临床试验存在。Abata Therapeutics公司设计了自体Tregs来表达一种特异性识别中枢神经系统中免疫原性髓鞘碎片的TCR（ABA-101，NCT06566261）。2025年底，Gentibio公司的GENTI-122开始了一项1期临床试验，这是一种用于治疗T1D的转化型Treg产品，其中CD4⁺ T细胞被工程化以表达FOXP3、一个化学诱导信号复合体（CISC）（提供对雷帕霉素响应的IL-2信号支持）以及识别胰腺胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基相关蛋白（IGRP）肽的IGRP305-TCR（NCT06919354）。将TCR工程化Tregs的临床前研究结果推进到临床试验需要更多的工作，而首批TCR工程化Treg试验将为未来的产品优化提供关键数据。

2.4 CAR工程化Tregs

彻底改变癌症免疫疗法的嵌合抗原受体（CAR）技术已被应用于改造Tregs，以增强其特异性和功能。CAR Tregs表达合成受体，这些受体独立于MHC呈递识别细胞表面抗原，结合了抗体的特异性和细胞内信号传导，导致Treg活化和调节功能。最初的临床前研究表明，靶向HLA-A2、因子VIII或髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）的CAR Tregs可以分别抑制同种免疫、血友病中针对因子VIII的自身免疫或实验性自身免疫性脑脊髓炎。CAR Tregs的首批临床试验现已进行中，包括一项针对预防肾移植排斥的HLA-A2特异性CAR Tregs的1/2a期试验（Sangamo Therapeutics，NCT04817774）或肝移植排斥（Quell Therapeutics，NCT05234190），针对类风湿性关节炎的瓜氨酸化波形蛋白特异性CAR Tregs（Sonoma Therapeutics，NCT06201416）和化脓性汗腺炎（NCT06361836），以及针对GvHD的CD6特异性CAR Tregs（NCT05993611）。虽然尚未进入临床试验，但Tr1X Bio公司正在开发TRX319，一种用于治疗多种B细胞介导的自身免疫性疾病的同种异体多克隆CAR Treg疗法。CD19-CAR Tregs与癌症免疫疗法不良结果相关的发现进一步强调了CAR Treg疗法在临床环境中用于体内抑制的潜力。CAR Treg方法提供了一些潜在优势，包括MHC非依赖性识别、可调节的信号域和多样化的靶向选项。然而，CAR Treg生物学的复杂性带来了独特的挑战，例如平衡激活和稳定性、防止因CAR tonic signaling导致的耗竭或可塑性，以及解决制造方面的考量。

利用我们最近发布的Treg疗法临床试验列表，我们检索了每个干预性试验的数据，并在补充表S1中呈现了结果，如图1所示。多克隆Treg方法是最成熟的，截至2025年底占试验的83%。转化型Tregs正在兴起（占所有Treg试验的6%）。在工程化Treg细胞疗法中，CAR Treg方法比TCR工程化Tregs更成熟（分别占所有Treg试验的9%和3%）。其他形式的工程化或“修饰”Tregs是否可以在临床中开发利用仍有待确定，例如利用Treg代谢或增强癌症环境中的炎症活性。

3 Treg免疫监测技术

3.1 Treg追踪方法

历史上，Jeffrey Bluestone的团队开创了第一种体内追踪Tregs的方法。该技术涉及在输注前用氘（2H）标记Tregs，以实现对细胞持久性和增殖的长期追踪。通过在体外扩增期间在氘标记的葡萄糖或含有氘水的培养基中培养Tregs，Tregs将稳定同位素掺入新合成的DNA和蛋白质中。转移后，可以通过质谱法在血液和组织样本中检测到氘标记的Tregs，从而评估持久性、增殖和组织分布。一项针对1型糖尿病的氘标记多克隆Tregs的I期试验显示了安全性，并且转移后长达一年内可检测到Tregs。该技术为体内Treg动力学提供了独特见解，而无需基因操作，对于不可行基因追踪方法的临床研究具有优势。

工程化Tregs在临床试验中的基因追踪可以通过编码一种惰性且非免疫原性的人类细胞表面转基因蛋白来实现，该蛋白可通过流式细胞术和免疫组织化学检测。一个例子是截短的表皮生长因子受体（EGFRt），它可以通过获得良好生产规范（GMP）认证的西妥昔单抗抗体进行检测。EGFRt用于CD19-CAR T细胞试验（NCT05625594）。它也常用于CAR Tregs的临床前测试。除了作为工程化Treg的追踪工具外，EGFRt还可以在输注前富集工程化细胞，并作为“安全开关”，在发生毒性或恶性肿瘤时通过西妥昔单抗介导的体内清除发挥作用。另一个用于追踪Tregs的细胞表面转基因蛋白的例子是截短的神经生长因子受体（tNGFR），也称为LNGFR或CD271，用于GMP兼容的输注前富集、输注后追踪和工程化Tregs的定量。tNGFR转导的细胞已被证明是安全的，并在CD4^LVFOXP3细胞治疗IPEX的I期临床试验（NCT05241444；见上文）中生成。或者，可以使用抗体检测功能性的工程化Treg蛋白，例如CAR或TCR。例如，CAR独特型抗体特异性针对CAR结构的scFv结合口袋。基因Treg标志物的抗体介导检测可以通过CITE-seq或空间技术（如免疫组织化学（IHC）或CODEX）与单细胞技术结合，尽管CAR独特型抗体在空间应用中通常有过高的背景信号。编码工程化蛋白的DNA或RNA转录本仍然可检测，并且可以使用定量实时PCR、高灵敏度数字微滴PCR（ddPCR）、单细胞测序或空间转录组学进行追踪，以识别输注的Tregs。总体而言，工程化细胞追踪技术提供了关于工程化Tregs在人体内持久性和生物分布的数据。

3.2 评估Treg表型、稳定性和功能

3.2.1 流式细胞术和质谱流式细胞术

流式细胞术仍然是临床样本中Treg识别和表征的基石。常规 panel 通常包括标记物如CD4、CD25、CD127和FOXP3，以及活化标记物（例如CD39）、归巢受体（例如CCR4）和功能标记物（例如Ki-67）。光谱流式细胞术 panel 能够实际定量30-40个标记物。质谱流式细胞术（CyTOF）通过使用金属标记抗体实际检测40-50个参数来扩展此能力，允许以最小的光谱重叠进行更全面的表型分析。这种方法通常应用于批处理的冷冻保存样本，揭示了Treg区室内先前未被认识的异质性以及与临床结果相关的不同Treg亚群。基于流式细胞术的监测的关键考虑因素包括深思熟虑的抗体 panel 开发和验证、染色程序的标准化（例如使用冻干、预混合的抗体 panel，格式化为单珠等分试样）以及包含在测试样本中表达所有标记物直至最大水平的批次对照。这些方法可以提供关于Treg持久性和稳定性、功能和归巢标记物评估、运输模式以及免疫系统整体状态的关键信息。

3.2.2 单细胞测序

单细胞RNA测序（scRNA-seq）使得能够深入表征体内细胞异质性，并在干细胞移植后追踪Tregs重建过程中被证明至关重要。scRNA-seq提供的单个细胞的全面转录谱揭示了功能状态、活化状态以及可能被基于蛋白质的方法遗漏的表型和功能稳定性的潜在丧失。在Treg疗法的背景下，scRNA-seq可用于识别与治疗效果或毒性相关的转录特征和通路，通过与单细胞TCR测序（scTCR-seq）整合追踪输注Tregs的克隆动力学，通过表达非Treg谱系基因检测谱系不稳定性，通过CITE-seq纳入关键蛋白的表达，以及通过相互作用组分析绘制Tregs与其他免疫或组织细胞之间的相互作用图谱。

转座酶可及染色质测序（ATAC-seq）通过量化开放染色质区域提供细胞表观遗传景观的见解。当应用于Tregs时，该技术揭示了控制Treg身份和功能的调控元件，包括那些与FOXP3表达和稳定性相关的元件。单细胞ATAC-seq（scATAC-seq）可以识别治疗期间Treg亚群中发生的表观遗传变化，有可能在它们在转录或蛋白质水平上变得明显之前预测功能改变。此外，scATAC-seq可以评估工程化Tregs在表观遗传上（包括在FOXP3基因座）在多大程度上重现了天然Tregs，提供关于细胞稳定性、增强子活性以及Tregs为未来细胞状态“预准备”的程度的信息。通过多组学方法将scATAC-seq与scRNA-seq数据整合，能够进行轨迹推断，同时提供更完整的Treg细胞状态和动力学图像。

单细胞测序技术用于Treg临床试验的主要限制是成本和有限的细胞数量。因此，相关性研究通常利用荧光激活细胞分选（FACS）在scRNA-seq或scATAC-seq之前富集感兴趣的群体——例如来自血液的输注Tregs。通过选择信息量最大的样本、在批量分析中对样本进行条形码编码和合并，以及利用快速发展的技术和单细胞测序试剂盒，可以进一步降低成本。

3.2.3 空间组学

空间组学技术建立在原始空间分析方法的基础上，包括苏木精和伊红（H&E）染色、IHC和免疫荧光。单细胞空间转录组工具，包括Nanostring CosMx、10x Genomics Xenium和Vizgen MERSCOPE，利用探针检测预设的多达6,000个基因的 panel，并支持针对工程化蛋白（如CAR或TCR）的自定义探针。空间蛋白质组学技术，包括MIBI和CODEX，可以代替或与空间转录组学方法并行使用，以从相关的组织活检中获取见解。空间组学方法已应用于肾移植Treg疗法的研究，可能对于全面分析Treg试验中相关组织活检内的免疫状态、检测组织中的Tregs并定义其表型，以及检查Treg富集的有组织淋巴结构（如果存在）至关重要。除了评估Treg持久性、表型和微环境外，空间转录组学可以定义空间细胞-细胞通讯。空间组学技术的重要优势是空间信息，以及与解离组织的单细胞分析相比更准确的细胞比例。空间组学的局限性包括由于不完美的细胞分割和溢出效应导致的细胞类型分离精度较低、空间蛋白质组学背景比流式细胞术高，以及空间转录组学比单细胞测序有更高的dropout率。从连续组织活检构建组织微阵列（TMA）可以降低空间组学分析的成本。

3.2.4 TSDR去甲基化

Tregs的生物学不稳定性是Treg细胞疗法的一个关注点，因为输注的细胞在暴露于体内炎症环境时可能失去其特性。这种不稳定性表现为FOXP3下调、表型转化、促炎细胞因子产生以及不可预测的治疗效果。虽然单细胞技术可以评估Treg表型以推断稳定性，但DNA甲基化信息被认为是金标准。Treg身份和稳定性与FOXP3基因座特定调控区域，特别是Treg特异性去甲基化区域（TSDR）的去甲基化密切相关。TSDR去甲基化的定量分析可作为真正Tregs的可靠衡量标准，并可用于追踪输注的Treg细胞产品随时间的稳定性。

3.2.5 Treg功能测定

评估临床样本中治疗性Tregs的功能仍然是一个活跃的方法开发领域。除了抗原特异性抑制外，Tregs可以诱导对与其原始抗原特异性不同的抗原的旁观者抑制。传染性耐受是一种可能在Treg疗法背景下发生的现象，即Tregs诱导Tconv和其他免疫细胞产生耐受，有效地将其调节功能“传播”超出其直接或旁观者抑制效应，并且即使在治疗性Tregs减弱后也可能持续存在。尽管体外抑制或抗原特异性抑制测定可以提供血液样本中Treg功能的证据，但多年收集、储存和运输的临床样本质量可能并不总是足以进行功能测定。基于流式细胞术或scRNA-seq分析的治疗性Tregs通路活性或增殖标记物可以提供功能证据。此外，测量调节性血浆细胞因子（例如IL-10、TGF-β）与炎症细胞因子的变化可以提供功能证据和传染性耐受的间接证据。传染性耐受和旁观者抑制可以分别使用流式细胞术、单细胞测序、TSDR去甲基化以及空间组学分析非治疗细胞的耐受性特征和炎症特征的减少来评估（例如，FOXP3⁺Helios^– T细胞的增加可能表明新生的Treg诱导）。最后，使用H&E、IHC和空间组学方法的组合检查相关组织病理学中疾病特异性特征的减少、与耐受相关的组织结构（例如TOLS）以及非治疗细胞的耐受状态，可以提供关于治疗性Treg抑制和原位传染性耐受的重要信息。临床疗效最终是评估治疗性Treg功能的最重要指标，通过疾病特异性指标进行评估。

3.3 监测Treg排斥

免疫系统可能识别同种异体Tregs或基因修饰Tregs中的外来抗原，例如CAR中的scFv或TCR中的连接序列，导致对治疗性Treg细胞的体液（抗体介导）和细胞（T细胞介导）排斥。体液排斥可以通过血清样本的ELISA来检测针对工程化蛋白的抗药物抗体。细胞排斥可以在患者来源的外周血单核细胞（PBMCs）中测试（例如，针对跨越工程化蛋白的肽）通过ELISpot检测IFN-γ产生。当治疗性Tregs不能持久存在时，监测Treg排斥可以提供有价值的信息。

4 操作考量与未来方向

4.1 最大化Treg相关性研究的见解

为了从Treg临床试验中最大化生物学见解，我们推荐一种标准化但灵活的方法来收集样本和进行相关性分析。纵向外周血样本应在基线（如果适用，最好在单采血液成分术时）、输注后即刻（第1-2天）、早期（第7-14天）、中期（第4-