一种用于氧化环氧基碳纤维增强聚合物（CFRPs）的联合化学-酶法处理方法

《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：A combined chemo-enzymatic treatment for the oxidation of epoxy-based carbon fiber-reinforced polymers (CFRPs)

碳纤维增强环氧树脂通过丙酸-过氧化氢预处理结合细菌漆酶实现高效回收。预处理有效分解环氧基体，释放清洁碳纤维；分离自松树皮蛀虫的ItL-03漆酶在pH 4、50°C条件下活性最高，可进一步氧化环氧模型化合物（如NNBT）中的C-N键，部分降解树脂结构。酶动力学分析显示其对ABTS介导体系活性最佳，且热稳定性优异。此生物启发式方法为工业级CFRP回收提供了新思路。

　　碳纤维增强聚合物（CFRPs）因其优异的机械性能和轻质特性，已成为航空航天、汽车和风能等行业不可或缺的材料。然而，目前缺乏一种既环保又能够高效回收碳纤维的可持续技术。尽管某些细菌和真菌能够定植于环氧树脂，但尚未发现能够有效降解这些材料的酶。因此，迫切需要一种高效、可持续且生物启发的解决方案来解决CFRPs的回收难题。本研究提出了一种化学-酶促两步氧化处理方法，通过化学预处理（使用丙酸和过氧化氢）来回收嵌入的碳纤维，同时利用三种从欧洲云杉树皮甲虫肠道宏基因组中分离的新型细菌漆酶（来自 *Ips typographus*），展示了其对三种基于TGMDA环氧树脂的结构支架的氧化能力。这一生物启发方法为开发基于生物的CFRPs回收策略迈出了第一步。

环氧树脂是一种热固性聚合物，因其出色的机械性能、高热和化学稳定性，在材料工程中发挥着关键作用。这些特性来源于环氧树脂在固化过程中形成的三维网络结构。环氧树脂通常含有两个或多个环氧基团，通过与不同的固化剂（如脂肪族和芳香族胺、酸酐、硫醇和酸）结合，可以针对特定应用进行定制。这种灵活性使其成为航空航天、汽车和建筑等行业中碳纤维增强聚合物的首选材料。值得注意的是，当前商业飞机结构中CFRPs的重量占比高达53%。全球对CFRPs的需求正以每年约10%的速度增长，预计到2025年，全球产量将达到285,000吨。此外，预计到2036年将有约7,000架飞机退役，而仅航空业每年预计就会产生约500,000吨的CFRPs废弃物。这些趋势表明，未来几十年内，CFRPs废弃物的量将显著增加，迫切需要有效的处理和回收策略。

目前，化学回收（或溶剂解聚）被认为是回收碳纤维和树脂基质的最有希望的方法之一。然而，挑战依然存在，特别是在寻找具有低环境影响、能够在低温低压条件下操作的溶剂方面。尽管已有进展，但尚缺乏一种可持续的、生物启发的环氧基CFRPs降解方法。环氧树脂的生物降解仍然困难，因为其合成特性：高度交联的结构、稳定的化学基团（如醚键和三级胺）以及缺乏易于水解的键。虽然一些细菌如 *Pseudomonas* 和 *Bacillus flexus* 能够定植并降低环氧涂层的耐腐蚀性，但像 *Ideonella sakaiensis* 这样能够有效降解聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）的微生物及其相关酶的研究尚未在环氧树脂领域取得突破。

本研究开发了一种化学-酶促的两步氧化处理方法，用于环氧基CFRPs的回收。通过丙酸和过氧化氢的化学预处理，有效分解了基于双酚A二缩水甘油醚（DGEBA）的复合材料，同时回收了干净的碳纤维，这些碳纤维具有再利用的潜力。研究还筛选了三种新型细菌漆酶，这些漆酶来源于欧洲云杉树皮甲虫的肠道宏基因组，针对一种在航空航天领域常用的基于TGMDA环氧树脂的结构支架进行了测试。研究结果表明，漆酶能够将预处理后产生的可溶性寡聚物进一步氧化，并对环氧树脂表面的暴露官能团进行部分修饰，为环氧基CFRPs的生物回收策略提供了初步探索。

在材料和方法部分，研究人员首先采集了欧洲云杉树皮甲虫样本，并通过使用Theysohn槽式陷阱和甲虫信息素Ipsowit?进行诱捕。收集的样本随后被保存在-20°C环境中，并通过96%乙醇进行消毒，再固定在石蜡板上。在解剖过程中，样本被浸入无菌的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，提取其肠道组织并保存在-20°C下。为了获得宏基因组数据，研究人员在德国汉堡的Heinrich Pette研究所进行了DNA提取和测序。使用NEBNext? Ultra? DNA Library Prep Kit for Illumina?构建基因组文库，并通过BioAnalyzer High Sensitivity Chip进行质量检测。测序在Illumina HiSeq 2500上进行，生成2×125 bp的配对端读数。数据经过Trimmomatic软件v.0.32进行质量修剪，并使用IDBA-UD软件v.1.1.1进行组装。数据上传至GOLD数据库，并通过DOE-JGI管道进行注释，最终存储在IMG数据库中，其基因ID为ItL-01, Ga0063521_10002204; ItL-02, Ga0063521_100014138; ItL-03, Ga0063521_100024328等。研究人员通过关键词“多铜氧化酶”在IMG宏基因组中进行了搜索，最终筛选出六个候选基因，其中包含了完整的四个铜结合位点（CBS）结构域。

在生物信息学分析部分，研究人员从公共序列数据库NCBI、UniProt和IMG中获取了潜在漆酶和已知漆酶的氨基酸序列，并通过BLASTp进行本地比对。使用T-Coffee服务器的Expresso模式对氨基酸序列进行了比对分析，构建了基于最大似然法和JTT模型的系统发育树，并进行了1,000次Bootstrap重复。通过AlphaFold 3预测了3D结构模型，并使用Consuf服务器分析了蛋白质的进化保守性。最终，使用UCFS Chimera v.1.16对模型进行了可视化。

在分子克隆、蛋白表达和纯化方面，研究人员将MCO基因进行了密码优化，以便于 *E. coli* 表达。使用的菌株、质粒和引物信息详见补充表S2。基因被插入到pET21a (+)表达载体中，ItL-01–03被转入 *E. coli* BL21 (DE3)中，而CueO则被转入 *E. coli* T7 Shuffle中。通过在自诱导培养基中生长，培养物在37°C下培养至OD600为0.6，随后补充250 μM CuSO4，并在28°C下培养16–20小时。细胞被收获、用1 mM 苯甲磺酰氟（PMSF）处理，并使用French press（1,250 psi）进行裂解。蛋白通过Ni-NTA琼脂糖进行纯化，并使用30 kDa Amicon管进行透析。

在生物化学特性分析中，研究人员通过使用ABTS（2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)）进行一系列分光光度测定，以表征重组漆酶。检测波长为420 nm，使用Synergy HT微孔板读数器进行测量。在每项测试中，2 μM漆酶与1 mM ABTS在200 μL的96孔板中反应，并补充1 mM CuSO4。初始测试确定了最佳pH值，范围在pH 3至7之间，随后在20°C至80°C范围内进行温度优化。缓冲液偏好在pH 4时使用0.1 M的柠檬酸-磷酸缓冲液和乙酸缓冲液进行评估。热稳定性测试在30°C至60°C下进行7天。此外，还测试了不同浓度的Cu2?（0 μM至1 mM）对漆酶活性的影响。

通过分光光度计测定，研究人员确定了漆酶的米氏常数（Km）、最大反应速率（Vmax）和转换速率（Kcat）。在pH 4的0.1 M乙酸缓冲液中，对ABTS进行反应，以30分钟为时间点，计算初始速率。研究还对ItL-03在不同pH和缓冲液下的活性进行了详细分析。ItL-03在pH 3.0至3.8之间保持超过90%的活性，表明其具有显著的酸性偏好。考虑到最佳pH范围相似，选择了pH 4.0作为进一步研究的条件。

在漆酶对环氧树脂模型底物的活性评估中，研究人员测试了三种底物：双(4-二甲氨基环己基)甲烷（BBCM）、1,3-双(甲基(苯基)氨基)丙-2-醇（BMAP）和N,N-双(2-羟基丙基)-对甲苯胺（NNBT）。这些底物含有环氧树脂中的关键基团，如三级胺，它们是基于TGMDA环氧树脂系统（常用于航空航天领域）的代表性模型。研究使用液相色谱-质谱（LC-MS）技术进行分析，观察到漆酶对这些底物的氧化活性。其中，ItL-03表现出最高的活性，能够在2小时内几乎完全转化三种底物，达到80%的转化率。此外，研究人员还测试了不同媒介物（如ABTS、syringol和guaiacol）对ItL-03活性的影响，发现syringol在氧化活性方面表现出更高的效果，而guaiacol则具有较低的特异性。通过这些实验，研究人员进一步验证了ItL-03在氧化环氧树脂模型底物方面的潜力。

在预处理分析部分，研究人员使用了来自Goodfellow Ltd.的碳纤维-环氧树脂复合材料（eCFRPs），其由Toray T300碳纤维（或等效材料）和Elantas EC157环氧树脂（或等效材料）组成。该材料的详细配方和固化信息未由制造商提供。研究人员将基于DGEBA的复合材料切割成6×12 mm的样品，并在不同浓度的酸-过氧化氢溶液中进行预处理。这些溶液包含5 M或9 M的酸和H2O2，比例为95:5。预处理时间分别为8、24和48小时，温度为65°C，持续摇晃200 rpm。对照组则暴露于酸、H2O2和水。预处理后，样品被用温水彻底清洗，并在60°C下干燥过夜。通过DIN EN 2564:2018标准，研究人员测定了树脂质量分数，并计算了树脂质量损失率。

通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析，研究人员观察到了预处理后环氧树脂中某些化学键的变化。测试范围为4,000至650 cm?1，分辨率为2 cm?1，每个光谱由50次扫描组成，温度为27°C。在TGMDA基环氧树脂粉末的测试中，光谱范围为4,000至600 cm?1，扫描次数为32次。数据通过OPUS软件进行处理，归一化为[0,1]，并使用Savitzky-Golay滤波器（20点）进行平滑处理。通过FTIR分析，研究人员发现酸-过氧化氢预处理显著降低了C–N键的伸缩峰（约1,030 cm?1和1,240 cm?1），表明环氧树脂发生了氧化反应。此外，AA-和PA-H2O2处理后的样品在C=C区域表现出更高的峰强度，这可能与形成羰基有关。这些结果表明，酸-过氧化氢预处理能够有效分解环氧树脂，并回收干净的碳纤维。

通过扫描电子显微镜（SEM）分析，研究人员观察到了预处理后碳纤维的形态变化。使用LEO 1525场发射扫描电子显微镜，在5–10 kV的高电压和8.1–9.6 mm的工作距离下进行成像。数据通过SmartSEM V06.00软件进行处理。结果表明，PA-H2O2处理后的样品中碳纤维变得明显可见，且形态与欧洲标准下的处理结果相似。此外，通过能量色散X射线光谱（EDX）分析，研究人员发现回收的碳纤维主要由碳（C）组成，氧含量极低，这可能是由于制造过程中杂质的存在。

在化学-酶促氧化实验中，研究人员合成了一种基于TGMDA的环氧树脂系统，并将其研磨成粉末（粒径≤0.6 mm）。将TGMDA基环氧树脂粉末浸入5 M丙酸/H2O2（95:5）溶液中，体积为60 mL/g，在65°C下持续摇晃230 rpm进行48小时预处理。预处理后的溶液通过5 M NaOH中和，并用二氯甲烷（DCM）进行提取。去除DCM后，沉淀物被重新悬浮在DMSO中，比例为10:1（基于原始DCM体积），形成“提取的环氧树脂”。剩余的粉末被过滤、用清水洗涤并在60°C下干燥过夜。通过中和和提取，研究人员确保残留的酸和H2O2被完全去除，从而降低后续酶处理过程中酶失活的风险。

研究人员将10 μL提取的环氧树脂与0.1 U/mg的ItL-03、5 mM CuSO4和5 mM ABTS（或无媒介物）在0.1 M乙酸缓冲液（pH 4）中混合，并在50°C下持续摇晃900 rpm，分别在2小时和24小时后采集样本。使用牛血清白蛋白（BSA）作为对照。提取后的样品用DCM（1:1）处理，并在13,000 rpm下离心5分钟，收集有机相进行质谱分析。此外，非处理和预处理的环氧树脂粉末分别与0.05 U/mg的ItL-03在相同条件下孵育5天。测试了不同媒介物（如ABTS、syringol和TEMPO）在最佳pH条件下的效果，其中TEMPO在pH 4下表现最佳。预处理后的样品在60°C下干燥过夜，用于FTIR分析。

通过直接电喷雾电离质谱（ESI-MS）分析，研究人员观察到预处理后的环氧树脂在质谱中表现出多种小分子化合物的信号。然而，在24小时的ItL-03处理后，某些离子（如m/z 483.3）的丰度显著降低，尤其是在添加ABTS的情况下。此外，m/z 354.2和501.3的离子在漆酶处理样品中也表现出较低的丰度。这些结果表明，漆酶可能对某些预处理后产生的副产物进行了转化或氧化。虽然这些趋势在酶处理样品和对照组中具有一致性，但部分结果（如m/z 113.9和127.0）未达到统计学显著性。因此，研究人员认为，需要进一步通过MS/MS或核磁共振（NMR）技术确认这些化合物的结构。

通过气相色谱-质谱（GC-MS）分析，研究人员观察到PA-H2O2处理后的环氧树脂分解为具有特定保留时间的化合物（如7–9分钟和12–14分钟）。在ItL-03/ABTS处理的样品中，出现了新的峰（如C和D），而BSA对照组中未观察到这些峰。这些峰可能对应于环氧树脂中的某些片段或氧化产物。此外，ItL-03/ABTS处理后还检测到了一个显著的峰E，对应于m/z 144，这可能来自ABTS的碎片。这些结果表明，漆酶能够进一步作用于预处理后产生的某些副产物，这可能有助于改善后续应用和产物回收。然而，这些结构的鉴定仍需进一步实验确认。

在讨论部分，研究人员指出，近年来对合成材料（如环氧树脂）的生物降解研究逐渐增多，但尚未发现能够有效降解固化环氧树脂的微生物或酶。本研究首次展示了通过PA-H2O4预处理和漆酶ItL-03处理的两步氧化过程，能够部分修饰TGMDA基环氧树脂，并作用于某些低分子量产物。其他研究表明，结合预处理和酶处理可以提高非水解性聚合物的解聚效率。例如，Branson等（2023）通过在200°C下使用二乙二醇（DEG）和1%的锡（II）-2-乙基己酸酯对聚醚聚氨酯泡沫进行解聚，产生了低分子量的二碳酸酯，这些二碳酸酯可以通过尿素酶UMG-SP-2进一步水解，达到65%的转化率。类似地，Pre-treating LMWPE（低分子量聚乙烯）与m-chloroperoxybenzoic acid（mCPBA）和超声波处理可以提高酶的可及性，使环氧树脂的转化率达到约27%，释放出中链产物，如脂肪族羧酸。

研究人员认为，结合PA-H2O2处理和漆酶ItL-03处理的方案在提高环氧树脂修饰效率方面具有优势。漆酶在氧化预处理产生的可溶性寡聚物方面表现出更高的活性，而对预处理后的固化环氧树脂的修饰作用则相对有限。尽管预处理提高了酶的可及性，使酶能够作用于环氧树脂表面的官能团，但目前尚不清楚这些酶是否能够在树脂内部进一步断裂链。因此，需要进一步研究以明确这一机制。目前的环氧树脂修饰程度可能尚未满足工业需求，但漆酶对预处理后副产物的选择性为潜在的下游应用提供了优势，提示未来可以进一步优化酶促过程以适应工业需求。

为了提高环氧树脂的回收效率，研究人员建议扩大酶筛选范围，包括不同类型的环氧树脂，如二级胺（R–NH–CH2–R′）、羧酸酯（R–(C=O)–O–R′）、醚（R–O–R′）和硫醇（R–S–R′）等。此外，使用更高分子量的模型底物可以更全面地理解酶促机制，特别是对于具有高氧化还原媒介物的细菌漆酶。虽然丙酸可以通过微生物发酵（如 *Propionibacterium freudenreichii* 和 *P. acidipropionici*）生物生产，但需要通过方法如微通道蒸馏进行回收和再利用，以确保处理过程的可持续性。

有效的环氧树脂回收需要综合运用物理、化学和酶促方法。尽管仍存在诸多挑战，但本研究提出了一种创新的生物处理概念，为环氧废弃物管理提供了初步思路。未来的研究将致力于将这一概念转化为实际、可扩展的回收方法，以实现工业级应用。此外，进一步的实验将有助于明确酶促反应的机制，以及如何优化处理条件以提高回收效率。通过持续的研究和技术创新，有望开发出一种既环保又高效的CFRPs回收方法，从而减少对环境的影响，并推动循环经济的发展。