利用电化学阻抗谱适配体传感器同时高效检测结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）和SARS-CoV-2抗原

《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：Simultaneous and sensitive detection of Mycobacterium tuberculosis and SARS-CoV-2 antigens employing an electrochemical impedance spectroscopy aptasensor

结核分枝杆菌MPT64和SARS-CoV-2 S蛋白的同步检测方法基于电化学阻抗光谱(EIS) aptasensor开发，采用双屏打印金电极实现高灵敏度、特异性检测，检测限分别为0.053 pg/mL(缓冲液)和0.085 pg/mL(血清)对MPT64，0.319 pg/mL(缓冲液)和1.421 pg/mL(血清)对S蛋白，并通过接触角、原子力显微镜验证表面修饰效果，稳定性达22天。

　　本研究中，我们开发了一种基于电化学阻抗谱（EIS）的适配体传感器，能够同时检测结核分枝杆菌（*Mycobacterium tuberculosis*）的MPT64蛋白和严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）的S糖蛋白，这两种病原体在全球范围内都是常见的传染病病原。适配体传感器是一种新型的生物检测技术，其核心原理是利用特定的适配体分子与目标抗原的高亲和力结合，从而引起电化学信号的变化。本研究采用双平台策略，在印刷金电极（SPGE）表面固定两种针对不同抗原的适配体，使得传感器能够实现对两种病原体的同步检测，具备灵敏、特异和可重复的优点。

在实验过程中，首先对SPGE表面进行了功能化处理，通过硫醇修饰的适配体结合到电极表面，随后使用6-巯基-1-己醇（MCH）对电极表面进行封闭，以防止非特异性结合。经过10分钟的孵育时间后，使用EIS技术对目标抗原进行检测。实验结果显示，该传感器在缓冲液和人血清中均能有效检测目标抗原，其检测范围为0.01至10皮克/毫升（pg/mL），并且在缓冲液中对MPT64的检测限为0.053 pg/mL，对S糖蛋白的检测限为0.319 pg/mL；在人血清中，MPT64的检测限略有上升至0.085 pg/mL，而S糖蛋白的检测限为1.421 pg/mL。这一结果表明，该传感器在复杂生物样本中依然保持较高的灵敏度和特异性，为临床应用提供了重要的技术支持。

为了验证SPGE表面的功能化效果，我们采用了循环伏安法（CV）、接触角测量和原子力显微镜（AFM）等多种表征手段。CV测试结果显示，当适配体固定到电极表面后，电流显著下降，表明适配体成功结合到了电极表面，同时减少了非特异性结合带来的干扰。接触角测量进一步表明，适配体修饰和MCH封闭均显著改变了电极表面的润湿性，使得表面由原本的疏水性变为亲水性，有助于提高抗原结合的效率。AFM分析则提供了关于电极表面形貌的直观信息，揭示了适配体结合前后电极表面粗糙度的变化，进一步支持了传感器的稳定性与灵敏度。

在优化过程中，我们系统地研究了不同实验条件对传感器性能的影响，包括工作缓冲液的选择、适配体浓度、封闭剂的使用以及抗原孵育时间。结果显示，使用SELEX缓冲液作为工作缓冲液时，适配体与抗原之间的相互作用最为显著，且表现出良好的浓度依赖性。这表明SELEX缓冲液在适配体选择和固定过程中起到了关键作用。此外，适配体的浓度对传感器的响应也产生了重要影响，0.5微摩尔（μM）的适配体浓度在灵敏度和特异性之间达到了最佳平衡。而孵育时间的优化表明，10分钟的孵育时间能够提供足够的结合时间，同时避免了过长的孵育导致的非特异性吸附增加。

本研究的另一个重要发现是，该传感器在检测MPT64和S糖蛋白时表现出良好的特异性。通过将非目标蛋白（如猴痘病毒A29蛋白和中东呼吸综合征冠状病毒MERS-CoV的S糖蛋白）与目标蛋白在相同浓度下进行比较，我们发现传感器仅对目标抗原产生显著的电化学响应，而对非目标蛋白的响应则不显著。这表明该适配体传感器具有较高的选择性，能够有效区分不同的抗原，避免了交叉反应带来的干扰。此外，我们还测试了该传感器在人血清中的稳定性，结果显示其在22天内保持稳定的性能，说明该传感器具备长期储存和重复使用的潜力。

本研究的意义在于，为同时检测结核病和新冠病毒提供了新的思路和技术手段。传统的检测方法，如聚合酶链式反应（PCR）和培养法，虽然在灵敏度和特异性方面表现优异，但往往需要复杂的实验操作和较长的检测时间，难以满足快速诊断的需求。而本研究开发的适配体传感器则具有操作简便、检测快速、成本低廉等优势，尤其适合在资源有限的地区或临床现场使用。同时，该传感器的检测限非常低，能够有效检测微量的抗原，这对于早期诊断和疾病监控具有重要意义。

此外，本研究还强调了适配体传感器在实际应用中的潜力。通过将适配体传感器与微流控平台或便携式电化学读数设备相结合，可以进一步提升其在临床和现场检测中的适用性。这种技术的集成不仅能够提高检测效率，还能够降低对专业技术人员的依赖，从而实现更加便捷和普及的病原体检测。本研究的成果为开发高效、经济、易用的诊断工具提供了理论依据和技术支持，也为未来在多重病原体检测方面的研究开辟了新的方向。

在总结本研究的成果时，我们发现，适配体传感器的成功开发得益于多方面的优化与验证。从适配体的选择到电极的表面处理，再到检测条件的设定，每一个步骤都经过了细致的调整和验证。特别是在处理复杂的生物样本（如人血清）时，传感器依然能够保持较高的检测性能，这表明其在实际应用中的可行性。同时，通过表征技术（如CV、接触角和AFM）的辅助，我们能够更全面地了解传感器在不同阶段的性能变化，为后续的优化和改进提供了重要的参考。

本研究还提出了进一步的研究方向。尽管适配体传感器在实验室条件下表现出良好的性能，但在实际临床样本中的应用仍需进一步验证。因此，未来的研究可以集中在临床样本的检测，以评估其在真实世界中的诊断价值。此外，传感器的集成化和便携化也是重要的发展方向，例如通过与微流控芯片或手持式检测设备结合，使其能够在现场快速完成检测，从而提高疾病防控的效率。同时，我们还可以探索其他病原体的检测可能性，例如将该技术应用于其他呼吸道病原体的同步检测，以满足多重病原体诊断的临床需求。

总的来说，本研究成功开发了一种新型的EIS适配体传感器，能够同时检测结核病和新冠病毒的重要抗原。该传感器在灵敏度、特异性和稳定性方面表现出色，为临床诊断提供了重要的技术支持。同时，通过多种表征手段的验证，我们进一步确认了其在实际应用中的可行性。未来，随着技术的不断优化和集成，该适配体传感器有望成为一种高效、经济、易用的诊断工具，为全球公共卫生事业做出贡献。