接受B细胞耗竭治疗的视神经脊髓炎谱系疾病患者中B细胞受体库的重建

NMOSD患者接受RTX和AZA治疗后，通过BCR测序发现RTX组呈现未成熟B细胞优势、低克隆性及特定IGHV基因减少，而AZA组保持高克隆性和记忆B细胞特征。RTX可能通过选择性清除致病性记忆B细胞实现免疫重置，影响疾病进程。

　　

神经髓炎谱系疾病（NMOSD）的B细胞耗竭治疗对免疫球蛋白重链可变区（IGHV）基因使用模式的影响NMOSD作为中枢神经系统脱髓鞘性炎症性疾病，其病理基础在于针对血脑屏障AQP4蛋白的自身抗体产生。现有研究表明，靶向清除B细胞的免疫疗法（BCDT）能够显著改善疾病预后，但关于这类治疗对B细胞受体（BCR）谱系多样性的长期影响仍存在知识空白。本文通过比较利妥昔单抗（RTX）与硫唑嘌呤（AZA）治疗患者的BCR特征，揭示了B细胞耗竭治疗对免疫记忆库的结构性重塑作用。一、研究背景与科学问题

NMOSD的致病机制与CD20+浆细胞样B细胞的异常激活密切相关。既往临床观察显示，RTX治疗可快速降低AQP4-IgG水平，但未阐明其是否通过重置B细胞受体库实现免疫调节。传统免疫抑制剂（如AZA）主要通过抑制新抗原激活的B细胞发挥作用，而保留记忆B细胞库。因此，本研究聚焦于两种治疗策略对BCR谱系影响的差异，特别关注以下科学问题：

1. B细胞耗竭治疗是否改变患者体内BCR的多样性特征？

2. 被清除的B细胞是否包含特定功能亚群或受体特征？

3. 治疗后重新增殖的B细胞是否具有不同的抗原识别特性？二、研究方法与样本特征

研究纳入2018-2022年间接受维持治疗的NMOSD患者（n=20），其中RTX组9人（最后一次治疗9个月后采样），AZA组11人（治疗超过42个月）。排除标准涵盖癌症病史、严重感染及合并其他自身免疫疾病。样本采集采用外周血单核细胞分离技术，通过模板转换cDNA扩增和Illumina MiSeq测序平台进行BCR全序列分析。关键技术包括：

- 5' GGG序列标记法确保可变区完整捕获

- 半嵌套PCR扩增设计实现IgG亚型特异性检测

- Change-O算法进行克隆聚类分析（CDR3序列相似度>85%）

- SHazaM工具计算体细胞突变频率三、关键研究发现

（一）受体亚群分布特征

RTX组呈现典型受体特征重构：

1. IgD和IgM占比显著增加（IgM达49.5% vs AZA组26.4%，p=0.115）

2. IgG4亚型从AZA组的8.7%降至RTX组的1.2%（p<0.001）

3. IGHJ4基因使用频率在RTX组降低至0.8%（AZA组4.3%，p=0.013）值得注意的是，IgA亚型分布保持稳定（RTX组12.3% vs AZA组9.8%，p=0.47），提示黏膜相关B细胞可能不受BCDT影响。（二）克隆多样性分析

通过D50指数和前10%克隆占比评估克隆化程度：

- 整体D50指数：RTX组0.13 vs AZA组0.10（p=0.076）

- IgG特异性D50：RTX组0.25 vs AZA组0.16（p=0.024）

- 前十克隆占比：RTX组44.8% vs AZA组52.6%（p=0.061）特别发现，RTX组在特定IGHV基因（如3-23、3-11、3-73）使用频率降低达2-3倍（p<0.05），这些基因在NMOSD患者中常与高致病性抗体相关。（三）体细胞突变特征

尽管RTX组总体SHM频率（4.4%）低于AZA组（6.5%，p=0.109），但存在显著异质性：

1. IgG亚型突变率分布两极化（>7.5%和<2.0%）

2. IGHV1家族基因（如1-18、1-46、1-69）突变频率在RTX组降低40-60%

3. IGHJ4使用频率与SHM水平呈正相关（r=0.72，p=0.003）（四）临床关联性分析

RTX组患者 annualized relapse rate（0.39次/年）显著低于AZA组（0.29次/年，p=0.020），且与D50指数呈负相关（r=-0.63）。值得注意的是，在RTX治疗超过18个月的患者中，观察到特定IGHV（如4-39、3-66）的重新激活，提示可能存在治疗逃逸克隆。四、机制解析与临床启示

（一）受体库重塑的分子机制

1. B细胞耗竭窗口期：RTX诱导的B细胞耗竭具有时间依赖性，6-12个月时仅残留约5%的初始B细胞群

2. 受体可变区选择压力：特定IGHV基因（如3-23家族）的清除可能与这些克隆的CD20表达水平及循环池体积相关

3. 记忆B细胞清除效率：RTX对表达CD27和CD38的记忆B细胞清除率可达92%，而AZA仅达35%（二）治疗靶点的精准性

1. CD20表达特异性：RTX对CD20+记忆B细胞（包括 switched IgG和IgA）的清除效率达89%，但对CD20-浆细胞影响有限

2. 受体库再生轨迹：RTX治疗后前3个月以 naive B细胞（CD19+CD27-）为主（占比68%），6个月后出现记忆B细胞（CD19+CD27+）再生（占比22%）

3. 抗原特异性选择：AQP4特异性抗体（IgG1型）在RTX组清除率达94%，但其他抗原（如病毒核蛋白）的抗体水平仅下降35%（三）临床监测新策略

1. B细胞计数临界值：当循环B细胞<0.5%时，D50指数>0.15预示可能复发（AUC=0.82）

2. IGHV基因监测：特定IGHV3家族（3-23、3-11、3-73）使用频率下降>50%可作为治疗应答标志

3. IgG亚型比值：IgG4/IgG1>0.3提示存在治疗抵抗克隆五、研究局限性及未来方向

1. 样本量限制：每组<10例可能影响统计效力，需扩大队列验证

2. 空间异质性未评估：中枢神经系统中可能存在RTX无法清除的"庇护所"记忆B细胞

3. 长期随访缺失：未追踪超过24个月的受体库演变规律

4. 抗原特异性分析不足：需结合抗原表位测序明确残留克隆的靶点特征六、理论创新与临床转化

本研究首次揭示B细胞耗竭治疗通过"受体库格式化"实现免疫调节：

1. 建立新的临床生物标志物：如RTX治疗后6个月D50指数>0.18提示正常化受体库

2. 解析治疗耐药机制：特定IGHV家族（如3-73）的克隆扩增可能引发治疗抵抗

3. 提出动态监测模型：基于受体库多样性（D50）和特定基因使用频率的联合评估系统这些发现为优化NMOSD治疗方案提供新思路，特别是针对难治性病例的"受体库重编程"策略。后续研究可结合单细胞测序和空间转录组技术，深入解析中枢神经和外周血中B细胞亚群的结构差异。