硒纳米颗粒递送的MDM2抑制剂可重新激活p53，并重塑结直肠癌中的肿瘤免疫微环境

《Frontiers in Immunology》：Selenium nanoparticle-delivered MDM2 inhibitor reactivates p53 and reprograms tumor immune microenvironment in colorectal cancer

硒纳米颗粒负载MDM2靶向肽通过恢复p53功能及调控肿瘤免疫微环境显著抑制结直肠癌生长，安全性良好。

　　### 背景：结直肠癌的治疗挑战与p53通路的潜力

结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）是全球范围内发病率第三高、死亡率第二高的恶性肿瘤之一，对全球公共卫生构成了重大挑战。根据GLOBOCAN 2020的数据，全球每年新增约193万例CRC病例，死亡人数接近94万例。CRC早期症状通常不明显，导致患者常在晚期才被确诊，从而严重影响了治疗效果和生存率。目前，免疫治疗在癌症治疗领域取得了显著进展，然而，CRC患者对免疫检查点抑制剂（Immune Checkpoint Inhibitors, ICIs）的响应有限，特别是在微卫星稳定（Microsatellite Stable, MSS）型肿瘤中。MSS型CRC约占所有CRC病例的85%，其对免疫治疗的反应率较低，主要原因是肿瘤免疫微环境的抑制性特征以及免疫细胞的低浸润程度。因此，针对这一患者群体，开发新型治疗策略至关重要。

p53通路是肿瘤抑制的关键机制之一，被誉为“基因组的守护者”。在细胞受到DNA损伤等应激刺激时，p53蛋白被激活，能够诱导细胞周期停滞或细胞凋亡，从而阻止恶性转化的发生。在CRC中，p53基因突变常见于约50%-60%的病例中，导致p53功能丧失，促进肿瘤发生和进展。然而，约一半的CRC患者仍保留野生型TP53，这为通过功能恢复策略治疗这类患者提供了可能。除了其传统的细胞自主性抗肿瘤作用，p53还通过调控免疫反应发挥重要作用。例如，p53的缺失会削弱自然杀伤细胞（NK cells）的免疫监视能力，并抑制I型干扰素的产生，这在先天免疫途径（如cGAS/STING通路）中尤为关键。因此，p53功能的恢复可能不仅能够直接抑制肿瘤生长，还能通过重新编程免疫微环境来增强抗肿瘤免疫反应。

然而，传统的p53恢复策略面临诸多挑战，例如小分子抑制剂和肽类抑制剂容易被蛋白酶降解、半衰期短、细胞膜穿透能力差等。因此，开发一种能够克服这些障碍的新型治疗手段显得尤为重要。近年来，纳米药物递送系统因其优异的生物相容性、靶向性和缓释特性，成为解决这些问题的潜在方案。硒纳米颗粒（Selenium Nanoparticles, SeNPs）因其独特的物理化学性质，如良好的生物相容性、被动靶向肿瘤的能力（增强渗透和滞留效应，Enhanced Permeability and Retention, EPR效应）以及潜在的免疫调节功能，逐渐成为抗肿瘤药物递送的热门载体之一。基于这些特性，本研究开发了一种新型的纳米药物Se@MI，旨在通过靶向MDM2蛋白来恢复p53功能，从而同时发挥直接抗肿瘤作用和免疫调节效应，提高CRC治疗的有效性。

### 方法：Se@MI的制备与表征

本研究采用一种简便的一锅法合成策略，制备了靶向MDM2的MI肽负载硒纳米颗粒（Se@MI）。MI肽（序列：TSFAEYWALLSPC）通过固相肽合成法合成，并通过高效液相色谱（HPLC）和电喷雾电离质谱（ESI-MS）验证其纯度和分子量。合成过程首先将硒源（H?SeO?）与聚乙烯吡咯烷酮（PVP）混合，利用抗坏血酸作为还原剂，生成硒纳米颗粒。随后，将MI肽与纳米颗粒结合，形成稳定的纳米复合物。整个合成过程在温和的条件下进行，以确保肽与纳米颗粒之间的非共价结合，同时避免对肽结构的破坏。

为了全面评估Se@MI的物理化学特性，我们进行了多种表征手段。首先，通过透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）观察纳米颗粒的形态和大小，结果显示Se@MI具有均匀的球形结构，直径在45-50纳米之间，表明其具有良好的分散性和稳定性。其次，采用动态光散射（Dynamic Light Scattering, DLS）测量其水动力直径，结果表明Se@MI的平均粒径为50.75纳米，且具有单峰分布，进一步支持其在体液中的良好分散性。此外，通过紫外-可见吸收光谱（UV-Vis Spectroscopy）验证了Se@MI的组成，结果显示自由MI肽在210-230纳米范围内的特征吸收峰，而Se@MI纳米颗粒在260-280纳米范围内表现出额外的吸收峰，表明硒纳米颗粒与MI肽的成功结合。

为了评估MI肽在纳米颗粒中的负载效率和释放特性，我们进行了药物负载和释放实验。通过离心法去除未结合的MI肽，利用RP-HPLC分析其在纳米颗粒中的含量，结果显示MI的负载效率高达91.05%。此外，我们模拟了体内环境（如含有谷胱甘肽的PBS缓冲液）研究了MI的释放行为，结果表明在还原条件下，MI的释放率接近80%，而在非还原条件下则低于15%。这说明Se@MI具有良好的GSH响应性，能够在肿瘤细胞内实现靶向释放。同时，我们还监测了纳米颗粒在含20%胎牛血清的PBS中的稳定性，结果表明其粒径在24小时内无明显变化，表明Se@MI具有优异的体内稳定性。

为了进一步验证Se@MI的生物活性，我们进行了体外实验，包括MTT细胞毒性实验、流式细胞术分析细胞摄取情况、RNA测序和Western blot检测p53通路相关蛋白表达。在MTT实验中，Se@MI表现出显著的细胞毒性，其半数抑制浓度（IC??）为1.00 μM，且随着药物浓度的增加，细胞存活率逐渐下降。流式细胞术结果显示，Se@MI的细胞摄取率高达74.3%，远高于PBS对照组（0.15%）和单纯Se纳米颗粒（33.1%），表明其具有良好的靶向性和细胞渗透能力。RNA测序分析表明，Se@MI显著激活了p53信号通路（NES = 1.504，P = 0.029），并上调了p21、PUMA、Bax和cleaved caspase-3等关键凋亡相关蛋白的表达，进一步支持其通过p53通路诱导细胞凋亡的机制。

### 结果：Se@MI的抗肿瘤活性与免疫调节作用

在体外实验中，Se@MI表现出优异的抗肿瘤活性，能够显著抑制CT26细胞的生长。其细胞毒性不仅体现在对细胞存活率的降低，还通过诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞发挥作用。通过RNA测序和Western blot分析，我们发现Se@MI能够显著激活p53信号通路，并上调其下游效应蛋白的表达，如p21、PUMA、Bax和cleaved caspase-3，这表明其能够有效恢复p53的转录活性，并通过凋亡信号通路诱导肿瘤细胞死亡。

在体内实验中，我们构建了CT26小鼠结直肠癌模型，评估了Se@MI的抗肿瘤效果。结果表明，Se@MI能够显著抑制肿瘤生长，达到72.23%的肿瘤生长抑制率（TGI），远高于PBS对照组和单纯Se纳米颗粒组。通过H&E染色和TUNEL染色，我们观察到Se@MI治疗组的肿瘤组织表现出明显的细胞凋亡和组织结构破坏，进一步支持其抗肿瘤作用。此外，免疫组化分析显示，Se@MI治疗组的p53和p21表达水平显著提高，而MDM2的表达则有所增加，这可能反映了p53激活后的一种反馈调节机制。Ki67阳性细胞比例的降低也表明肿瘤细胞增殖受到抑制。

在免疫调节方面，Se@MI显著改变了肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）。通过免疫组化和流式细胞术分析，我们发现Se@MI能够显著增加CD8+ T细胞的浸润和活化，同时减少调节性T细胞（Regulatory T cells, Tregs）的数量。这表明Se@MI不仅能够直接杀伤肿瘤细胞，还能通过增强免疫细胞的活性来抑制肿瘤生长。具体而言，CD8+ T细胞在Se@MI治疗组中表现出更高的Granzyme B和IFN-γ表达水平，说明其具有更强的细胞毒性和免疫激活能力。此外，Treg细胞比例的显著下降进一步表明Se@MI能够减轻免疫抑制效应，增强抗肿瘤免疫反应。

### 安全性评估：Se@MI的生物相容性与毒性

为了确保Se@MI在临床转化中的可行性，我们对其安全性进行了全面评估。通过监测小鼠体重变化、血液学参数、主要器官的组织病理学变化以及血清炎症因子和肝肾功能标志物，我们发现Se@MI在体内具有良好的生物相容性。体重监测结果显示，治疗组与PBS对照组在10天内的体重变化无显著差异，表明其对全身代谢无明显影响。血液学分析表明，所有治疗组的白细胞、红细胞和血小板参数均在正常范围内，未观察到临床相关的异常变化。

组织病理学检查显示，Se@MI治疗组的小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏组织均未出现形态学异常或组织损伤，表明其对主要器官无毒性。此外，血清炎症因子（如TNF-α和IFN-γ）水平无显著升高，进一步证明其免疫原性较低。肝肾功能指标（如ALT、AST、BUN和CREA）也未出现显著变化，表明其对肝肾功能无影响。这些结果共同支持了Se@MI在体内具有良好的安全性和生物相容性，为其进一步临床转化提供了依据。

### 讨论：Se@MI的治疗潜力与临床意义

本研究开发的Se@MI纳米药物，不仅成功恢复了p53的转录活性，还通过增强免疫细胞的功能性反应，重塑了肿瘤微环境，为CRC治疗提供了新的思路。MSS型CRC由于p53功能的缺失，对免疫治疗的反应率较低，而Se@MI通过靶向MDM2蛋白，能够有效阻断MDM2与p53之间的相互作用，从而恢复p53的抗肿瘤功能。这种双重机制——直接抗肿瘤作用和免疫调节作用——可能为MSS型CRC患者提供更有效的治疗方案。

此外，Se@MI在体内表现出显著的抗肿瘤活性，其肿瘤生长抑制率达到72.23%，远高于现有治疗手段。这表明，通过纳米技术将MI肽递送至肿瘤部位，能够显著提高其治疗效果。同时，其对免疫微环境的重塑作用，使得原本免疫“冷”肿瘤（即免疫细胞浸润不足、免疫反应低下）转变为“热”肿瘤（即免疫细胞浸润增强、免疫反应活跃），从而提高其对免疫检查点抑制剂的响应率。这种协同效应可能为MSS型CRC患者提供新的治疗机会，尤其是在免疫检查点抑制剂治疗失败的情况下。

然而，尽管本研究取得了重要进展，仍需进一步考虑其临床转化的可行性。首先，由于研究基于小鼠模型，其在人体中的疗效和安全性仍需通过临床试验进行验证。其次，硒纳米颗粒的长期稳定性和体内分布情况仍需进一步研究，以确保其在人体中的安全性和有效性。此外，患者的TP53状态和MDM2表达水平可能影响治疗效果，因此，未来的研究需要结合分子标志物和免疫特征，实现更精准的患者分层和治疗选择。

在制造和应用方面，Se@MI的规模化生产需要在符合药品生产质量管理规范（GMP）的条件下进行，以确保其批次间的稳定性和一致性。此外，优化MI肽的序列结构，提高其特异性和活性，也是未来研究的重要方向。同时，探索Se@MI与其他免疫检查点抑制剂的联合治疗方案，将有助于提高治疗效果并克服肿瘤的耐药性。

综上所述，Se@MI作为一种新型的纳米药物，具有显著的抗肿瘤活性和免疫调节潜力。其通过恢复p53功能和重塑免疫微环境，为MSS型CRC患者提供了新的治疗策略。本研究不仅为CRC的治疗提供了理论支持，也为纳米药物在癌症治疗中的应用提供了实践依据。未来，随着进一步的临床验证和优化，Se@MI有望成为一种有效的抗CRC药物，为改善患者预后提供新的希望。