靶向Pin1以克服MSS结直肠癌中的免疫抑制性肿瘤微环境

《Frontiers in Immunology》：Targeting Pin1 to overcome immunosuppressive tumor microenvironment in MSS colorectal cancer

本研究发现PIN1通过激活NF-κB通路调控CCL3-CCR5轴，促进MSS结直肠癌免疫抑制微环境形成，表现为Treg细胞浸润增加和CAFs激活，导致免疫治疗抵抗。抑制PIN1联合PD-1阻断显著增强免疫疗效。

　　### 引言

结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）是全球范围内发病率和死亡率均较高的恶性肿瘤之一，对人类健康构成了重大挑战。尽管在治疗领域取得了诸多进展，但对于晚期或转移性CRC患者而言，治疗效果仍不理想，其5年生存率仅为约14%。传统的治疗手段，如化疗和靶向治疗，虽然在一定程度上改善了患者的预后，但其效果仍有限。近年来，免疫检查点阻断（Immune Checkpoint Blockade, ICB）技术的出现为CRC治疗带来了新的希望。PD-1、PD-L1和CTLA-4等免疫检查点抑制剂的使用显著提升了部分患者的生存率，特别是那些具有缺陷型DNA错配修复/微卫星不稳定性高（dMMR/MSI-H）的患者。然而，MSI-H仅占CRC病例的约15%，而其余85%的患者属于微卫星稳定（Microsatellite Stable, MSS）类型。由于MSS CRC对免疫治疗的响应较差，因此，探索改善免疫治疗效果的新策略和发现新的生物标志物显得尤为重要。

在MSS CRC中，免疫治疗抵抗的机制尚不完全明确。有研究认为，免疫细胞浸润不足和肿瘤突变负荷较低可能是导致这一现象的重要原因。例如，较高的CD3+淋巴细胞和CD8+ T细胞密度与较低的复发风险、较长的无病生存期和较高的总体生存率相关。此外，T细胞浸润水平与肿瘤的临床预后密切相关。由于MSS和MSI-H肿瘤在TME（Tumor Microenvironment）的组成和免疫细胞分布上存在显著差异，这直接影响了治疗反应和患者预后。MSI-H肿瘤通常表现出更高的免疫细胞浸润、更强的免疫相关基因表达和更高的免疫原性，而MSS肿瘤则表现出较低的突变负荷、较少的免疫细胞浸润和较低的免疫反应能力。因此，针对MSS CRC的新型联合治疗策略正在成为研究的热点。

### 方法

本研究采用了多种方法来探索Pin1在MSS CRC中的作用及其与免疫治疗的关系。首先，我们从TCGA-COAD数据库中获取了411例CRC患者的基因表达数据，并将其分为MSS和MSI-H两组。随后，我们利用平滑t统计量支持向量机（stSVM）算法，结合蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络信息，对基因表达数据进行分析，以识别与微卫星稳定性状态相关的生物标志物。为了进一步解析这些基因的功能，我们使用加权基因共表达网络分析（WGCNA）方法，以识别与MSS和MSI-H相关的基因模块和关键枢纽基因。此外，我们还利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，对371,223个肿瘤和邻近正常组织细胞进行了分析，以揭示不同表达水平下免疫细胞的分布特征。

为了验证Pin1的功能，我们选择了三种人类MSS CRC细胞系（HT29、SW480和SW620）以及两种MSI-H CRC细胞系（HCT116和HCT15），并使用DMEM培养基进行培养。同时，我们还获取了小鼠MSS CRC细胞系（CT26）和MSI-H CRC细胞系（MC38），以构建动物模型。通过干扰RNA（siRNA）技术，我们敲低了Pin1的表达，并通过qRT-PCR和Western blot分析了其在细胞水平上的影响。此外，我们还进行了细胞增殖（CCK-8）、迁移（划痕实验）和凋亡（流式细胞术）等生物学功能的评估。

为了进一步探讨Pin1对免疫细胞浸润的影响，我们建立了小鼠的皮下肿瘤模型和肝转移模型，并使用Pin1抑制剂（sulfopin）和抗PD-1抗体进行联合治疗。在动物实验中，我们测量了肿瘤体积的变化，并通过流式细胞术分析了肿瘤组织中CD3+ T细胞、CD8+ T细胞、CD4+ T细胞和Treg细胞的比例。同时，我们还进行了多重免疫组化（mIHC）实验，以观察Pin1在肿瘤组织中的表达及其与免疫细胞之间的关系。

为了探究Pin1对Treg细胞迁移和癌相关成纤维细胞（CAF）激活的影响，我们进行了共培养实验，将PBMCs（外周血单核细胞）与不同处理的CRC细胞共同培养，并通过流式细胞术和迁移实验分析了Treg细胞的活性和迁移能力。此外，我们还利用免疫荧光技术分析了Treg细胞和CAF的分布情况，并结合CCL3和CCR5的表达水平，进一步探讨了Pin1调控免疫细胞迁移的机制。

在分子机制层面，我们通过共免疫沉淀（Co-IP）和免疫荧光（IF）技术，验证了Pin1与p65之间的相互作用，并分析了Pin1对NF-κB通路激活的影响。同时，我们通过qRT-PCR和ELISA技术检测了CCL3的表达水平，并探讨了Pin1对CCL3分泌的调控作用。这些实验共同揭示了Pin1在MSS CRC中如何通过调控CCL3-CCR5轴影响Treg细胞迁移和CAF激活，从而塑造免疫抑制性TME。

### 结果

研究结果表明，Pin1在MSS CRC中表现出显著的高表达，并且其表达水平与CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的浸润程度呈负相关。在MSS CRC细胞中，敲低Pin1能够显著抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，并减少细胞迁移能力。这些结果表明，Pin1在MSS CRC的恶性表型中可能起到关键作用。

在动物模型中，Pin1抑制剂与抗PD-1抗体的联合治疗显著增强了免疫治疗的效果。具体表现为，联合治疗组的肿瘤体积较小，肿瘤重量较低，并且CD3+ T细胞、CD8+ T细胞和CD4+ T细胞的浸润程度显著提高，而Treg细胞的浸润程度则明显降低。此外，联合治疗还显著抑制了CAF的激活，进一步支持了Pin1在免疫抑制性TME中的核心作用。

通过单细胞测序数据的分析，我们发现MSS CRC中高表达Pin1的样本中，成纤维细胞、M2巨噬细胞和Treg细胞的比例显著增加，而CD4+和CD8+ T细胞的比例则相对较低。这一现象表明，Pin1可能通过调控免疫细胞的分布和功能，促进了免疫抑制性TME的形成。进一步的实验验证了这一假设，即Pin1通过上调CCL3的表达，激活了CCL3-CCR5轴，从而增强了Treg细胞的迁移能力。同时，Pin1的表达还与CAF的激活密切相关，这可能通过调控FAP（纤维化相关蛋白）的表达实现。

此外，我们还发现，Pin1的表达与NF-κB通路的激活有关。通过敲低Pin1，我们观察到p65（NF-κB的核心组分）的磷酸化水平和核转位能力显著下降，这表明Pin1可能通过激活NF-κB通路来促进CCL3的表达，从而调控Treg细胞的迁移和CAF的激活。这一发现进一步支持了Pin1在免疫抑制性TME形成中的核心作用。

### 讨论

本研究的结果表明，Pin1在MSS CRC中起着重要的调控作用。其高表达与免疫细胞浸润不足、Treg细胞的招募增加以及CAF的激活密切相关，这些因素共同促成了免疫抑制性TME的形成，从而影响了免疫治疗的效果。Pin1可能通过多种机制影响免疫细胞的功能，包括调控CCL3的分泌、激活NF-κB通路以及促进Treg细胞的迁移。这些发现为理解MSS CRC的免疫治疗抵抗提供了新的视角。

尽管本研究揭示了Pin1在MSS CRC中的关键作用，但仍存在一些局限性。首先，尽管我们观察到Pin1的高表达与肿瘤生长和免疫治疗反应相关，但TCGA队列的生存分析并未发现Pin1表达与总体生存率之间的显著关联，这可能与患者群体的异质性有关。其次，虽然Pin1抑制剂在实验中表现出良好的治疗潜力，但目前尚未有相关药物进入临床试验，其在体内的递送效率、长期安全性以及患者个体的反应性仍需进一步研究。此外，尽管Pin1抑制剂Sulfopin表现出较高的选择性，但在长期或高剂量使用时，其潜在的脱靶效应仍需在更大的动物模型或早期临床试验中进行验证。

从临床应用的角度来看，Pin1可能成为改善MSS CRC免疫治疗效果的重要靶点。通过调控免疫细胞的分布和功能，Pin1的抑制可能有助于重塑免疫抑制性TME，从而提高免疫治疗的敏感性。未来的研究可以进一步探讨Pin1在不同患者群体中的表达差异及其与免疫治疗反应的关系，同时开发更高效的Pin1抑制剂，以提高其在临床中的应用价值。

### 结论

综上所述，Pin1在MSS CRC中通过NF-κB-CCL3-CCR5轴促进了Treg细胞的招募和CAF的激活，从而重塑了免疫抑制性TME，推动了CRC的进展和免疫治疗的抵抗。这一发现为未来针对MSS CRC的免疫治疗提供了新的思路，即通过靶向Pin1，有望克服免疫治疗的局限性，提高治疗效果。Pin1作为潜在的治疗靶点，具有重要的临床价值，其相关研究将为改善MSS CRC患者的预后提供重要的理论依据和实践指导。