通过计算机模拟筛选发现的新登革热病毒抑制剂，这些抑制剂针对NS3-NS5蛋白之间的相互作用

《Frontiers in Microbiology》：New dengue virus inhibitors targeting NS3-NS5 interaction identified by in silico screening

本研究通过双结构导向虚拟筛选策略，成功鉴定出抑制登革病毒NS3-NS5相互作用的候选化合物hit3及其类似物，证实其具有低微摩尔量级、广谱血清型抗病毒活性，并通过分子动力学验证了hit3直接作用于NS5 RdRp口袋的机制，为开发新型抗登革病毒药物奠定了基础。

　　登革热病毒（DENV）是全球热带和亚热带地区最普遍的蚊媒病毒病原体之一，每年导致约1亿次人类感染。由于目前尚无针对DENV的抗病毒药物，开发有效的治疗策略变得尤为迫切。DENV的NS3和NS5蛋白之间的相互作用成为研究的重要目标，因为这种相互作用在病毒复制过程中至关重要，且在所有DENV血清型中高度保守。本研究通过两种不同的虚拟筛选方法，从超过300万种商业可得的药物样化合物中识别出能够抑制NS3-NS5相互作用的潜在抑制剂。两种筛选方法均显示出能够减少NS3-NS5结合的化合物，并且这些化合物在低微摩尔浓度下能够有效抑制DENV-2的复制，同时不具有细胞毒性。其中，化合物3表现出最高的选择性指数（SI），并显示了对所有四种DENV血清型的抗病毒活性。生物物理研究表明，化合物3通过直接结合NS5发挥抗病毒作用。随后，化合物3被用于结构-活性关系（SAR）研究，以识别保留抗DENV活性的结构类似物。本研究最终识别出一系列具有广谱抗DENV活性的新化学骨架，为开发新型抗登革热药物提供了有前景的基础。

DENV的广泛传播对全球公共卫生构成了重大挑战。目前，尽管已有两种四价疫苗（Dengvaxia和Qdenga），但它们的临床效果受到安全性和长期保护效力的限制。例如，Dengvaxia在未感染DENV的个体中可能增加严重登革热的风险，因此其使用受到严格限制。而Qdenga对DENV-1和DENV-2的保护效果较好，但对其他血清型的保护效果有限。因此，寻找能够广泛保护所有DENV血清型的抗病毒药物成为一项重要任务。

NS3和NS5蛋白作为DENV复制复合体中唯一的酶组分，在病毒RNA复制过程中发挥关键作用。NS3包含一个N端的丝氨酸蛋白酶结构域和一个C端的解旋酶结构域，而NS5则包含一个N端的甲基转移酶结构域和一个C端的RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）结构域。NS3和NS5之间的相互作用对于协调它们的酶活性至关重要，尤其是在DENV和其他黄病毒中。NS3的C端（残基566–585）和NS5的N端（残基320–341）构成了这一相互作用的界面。研究表明，Asn570（NS3）和Lys330（NS5）是维持这种相互作用的关键残基，且单个氨基酸替换（如N570A和K330A）可显著削弱DENV的复制能力。这些残基位于NS3的“site A”和NS5的“cavity B”中，这两个区域被提议为潜在的药物靶点。

本研究基于两种可用的DENV NS3和NS5晶体结构，进行了两次独立且互补的基于结构的虚拟筛选（SBVS），以识别新的NS3-NS5相互作用抑制剂。通过逐步提高筛选精度，筛选出的化合物被进一步验证，以确保其与目标结合位点的特异性。最终，23种来自NS3筛选的化合物和24种来自NS5筛选的化合物被选定，其中3种化合物在两种筛选中均被识别。这些化合物随后经过生物活性评估，包括抑制NS3-NS5相互作用的实验和抗病毒效果的测试。其中，化合物3表现出最强的抑制效果，其SI值超过130，并在感染的Vero细胞中显示出对所有四种DENV血清型的抗病毒活性。

为进一步评估化合物3的抗病毒效果，研究团队还合成了其结构类似物，并测试了它们对NS3-NS5相互作用的抑制能力。结果显示，其中7种类似物（编号64、66、69、71、72、76和79）表现出比化合物3更强的抑制活性，部分类似物的IC50值甚至降低了15倍。此外，这些类似物在细胞中也显示出类似的抗病毒效果，但部分表现出一定的细胞毒性。尽管如此，它们仍然具有较高的SI值，表明其具有较好的选择性。

生物物理分析表明，化合物3能够直接结合NS5的RdRp结构域，且其结合能力在微尺度热泳（MST）实验中得到了验证。MST实验结果显示，化合物3与NS5的结合常数（KD）为28.8 ± 4.5 μM，这一结合能力与其在ELISA实验中对NS3-NS5相互作用的抑制效果一致。分子对接模拟进一步表明，化合物3能够很好地嵌入NS5的“cavity B”中，并与关键的保守残基（如Lys330）形成稳定的相互作用。这些结果表明，化合物3通过与NS5的结合，有效地阻断了NS3-NS5的相互作用，从而抑制病毒复制。

本研究的结果不仅揭示了NS3-NS5相互作用的潜在药物靶点，还为开发新型抗登革热药物提供了重要的化学骨架。通过进一步的结构优化，有望获得更高效的抗病毒化合物，从而应对DENV的广泛传播和潜在的公共卫生威胁。此外，化合物3及其类似物在体外实验中表现出良好的抗病毒效果，同时具备较低的细胞毒性，为后续的临床研究提供了有希望的候选药物。未来的研究方向将包括设计更多结构类似物，以进一步优化其抗病毒活性和安全性，推动其在实际应用中的发展。