综述：亨廷顿舞蹈症干细胞疗法的发展前景

《Molecular Diagnosis & Therapy》：The Evolving Landscape of Stem Cell Therapies for Huntington’s Disease

本综述系统评述了干细胞疗法治疗亨廷顿舞蹈症（HD）的演进历程与前沿进展。文章批判性分析了从胎儿组织移植到基于人间充质干细胞（MSCs）和人类多能干细胞（hPSCs）的先进疗法（ATMPs）的临床研究，重点探讨了通过调控关键发育信号通路（如TGF-β、SHH、Wnt）体外分化hPSCs生成纹状体样神经祖细胞（NPCs）的策略。作者深入总结了临床前移植研究在移植物存活、神经元成熟、突触整合及功能恢复方面的证据，并讨论了直接重编程等新兴策略，最后指出了确保移植物安全性、一致性及符合监管要求等挑战，强调了国际合作对加速临床转化的关键作用。

　　

1 亨廷顿舞蹈症

亨廷顿舞蹈症（HD）是一种常染色体显性遗传的进行性神经退行性疾病，在西方人群中的患病率约为每10万人10.6至13.7例。其遗传基础是4号染色体上亨廷顿蛋白（HTT）基因内胞嘧啶-腺嘌呤-鸟嘌呤（CAG）三核苷酸重复序列的异常扩展。等位基因的CAG重复次数超过39次则表现为完全外显，而36至39次重复则显示外显率降低。这种突变导致产生突变亨廷顿蛋白（mHTT），其特点是具有延长的多聚谷氨酰胺链。

HD的发病机制主要归因于mHTT的毒性功能获得，导致蛋白质错误折叠和聚集、转录失调、线粒体功能障碍、兴奋性毒性、蛋白质降解途径受损和神经炎症。CAG重复次数与发病年龄呈负相关，发病后通常伴随进行性功能衰退和预期寿命缩短，症状出现后平均病程为15至20年。临床上，HD以运动、认知和精神障碍三联征为特征。运动症状包括舞蹈症、肌张力障碍和运动迟缓，在晚期常进展为强直和运动不能。认知缺陷——特别是在执行功能、注意力和记忆方面——可能在运动症状出现前的临床前期就早期显现。精神症状也很普遍，包括抑郁、焦虑、易怒、冷漠，在某些情况下还有精神病。

HD的潜在神经病理学特征是纹状体棘状投射神经元（SPNs）的进行性变性，这破坏了基底神经节回路，并导致运动、认知和情感功能障碍。在皮质和下皮质区域（如下丘脑）也观察到额外的神经变性，进一步导致了临床症状的异质性。目前，可用的治疗仅限于症状管理，无法改变疾病进程。因此，对疾病修饰疗法的需求极为迫切。在新兴策略中，基于干细胞的植入物作为一种潜在方法，有望修复受损的神经回路并改变HD的疾病进程，正获得越来越多的关注。

2 干细胞疗法

基于干细胞的疗法通过提供替换丢失或受损神经元、提供神经营养支持、调节炎症或增强神经可塑性的潜力，为治疗神经退行性疾病（包括HD）带来了希望。基于这种再生能力，几种细胞类型的移植疗法目前正在基础研究、临床前研究和临床试验中进行探索。

2.1 胎儿神经干细胞

胎儿神经干细胞（fNSCs）存在于人类胎儿组织中，是多能干细胞，能够分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。在过去的二十年中，早期临床研究评估了胎儿组织移植在HD患者中的应用，一致证明了该方法的安全性，但仅报告了对疾病进展和症状的轻微至适度效果。这些植入物背后的治疗原理包括两种潜在的作用机制：（1）细胞替代疗法（CRT），即移植的细胞旨在补充丢失的纹状体神经元；或（2）通过释放如脑源性神经营养因子（BDNF）等促进存活的因子来实现神经营养支持。尽管最初充满希望，但fNSCs的使用存在一些局限性。关于胎儿组织来源的伦理问题、有限的自我更新能力、获取受限以及与分离和扩增相关的技术挑战限制了其更广泛的临床应用。为了克服这些障碍，已经开发了逐步分化方案，从人类多能干细胞（hPSCs）中获得神经干细胞（NSCs）/神经祖细胞（NPCs）。

2.2 人类胚胎干细胞

人类胚胎干细胞（hESCs）是源自植入前囊胚内细胞团的hPSCs，通常在发育的第5至7天。由于其无限的增殖能力和分化为体内所有细胞类型的能力，hESCs代表了生成大量疾病相关细胞类型的有前途的来源。与fNSCs一样，hESC衍生产品的主要治疗目标是替换丢失的神经元群体。在过去的十年中，多个研究小组已经建立了体外分化方案，能够将hESCs导向纹状体样NPC命运，旨在在移植后实现功能性细胞替代。基于hESC的疗法已进入帕金森病（PD）的1期临床试验。这些试验的结果可能提供关键的概念验证并为HD的类似应用铺平道路。尽管具有潜力，hESC衍生的疗法也引发了重要的担忧。围绕胚胎来源细胞的相关伦理问题仍然存在争议。此外，由于残留的未分化细胞而固有的畸胎瘤形成风险，以及免疫排斥的可能性，需要严格的质量控制措施，并且在大多数情况下，需要使用免疫抑制。

2.3 人类诱导多能干细胞

人类诱导多能干细胞（hiPSCs）是通过异位表达特定的转录因子（TFs）将体细胞（如皮肤成纤维细胞或外周血细胞）重编程为多能状态而产生的。与hESCs类似，hiPSCs具有无限自我更新的能力，并且可以分化为任何细胞类型，包括区域特异性的NPCs。重要的是，hiPSCs可以从HD患者本身获得，为生成用于移植的自体细胞产品提供了可能性。这种方法不仅规避了与hESC使用相关的一些伦理问题，而且还有可能显著降低免疫排斥的风险。然而，患者来源hiPSCs的一个固有局限性是它们保留了mHTT基因，这可能损害神经元功能和存活。这严重限制了它们的直接治疗应用，因为自体移植物将携带与供体相同的致病突变。基因组编辑策略（例如，CRISPR/Cas9介导的校正）或使用同基因对照系正在被探索以克服HD患者来源hiPSCs的局限性。尽管存在这些挑战，基于hiPSC的疗法更广泛地面临额外的障碍，包括残留未分化细胞导致畸胎瘤形成的风险，以及在重编程过程中可能获得的潜在遗传异常。

2.4 间充质干细胞

间充质干细胞（MSCs）是通常从骨髓、脂肪组织或脐带血中提取的多能细胞。尽管它们在体内分化为成熟神经元的能力有限，但MSCs主要通过旁分泌信号发挥治疗作用。它们分泌一系列神经营养因子和免疫调节分子，支持神经元存活、减轻神经炎症并调节免疫反应。此外，MSCs具有向损伤部位迁移的内在能力——这种现象称为归巢——并且已被证明能够穿过血脑屏障，使得通过全身（例如，静脉内）给药成为可能。虽然MSCs不被认为是直接CRT的候选者，但它们易于分离和扩增、低免疫原性以及强大的免疫调节特性使其成为HD治疗的一个有吸引力的选择。

3 针对HD的基于干细胞的临床试验

3.1 已完成的临床试验

在人类中，纹状体起源于神经节隆起（GE），这是一个大约在受孕后7周出现的前脑结构。GE包括内侧神经节隆起（MGE），主要产生皮质和纹状体中间神经元；以及外侧神经节隆起（LGE），是SPNs和嗅球中间神经元的主要来源。因此，将胎儿GE组织（含有fNSCs）移植到HD患者的纹状体中被作为一种策略来替换丢失的神经元并修复受损的神经回路。

自1990年以来，总计有116名HD患者在开放标签的试点和多中心临床试验中接受了胎儿组织移植，包括全神经节隆起（WGE）或分离的LGE。试点研究旨在确定将胎儿神经组织移植到HD患者纹状体的安全性和可行性。已有30名患者的疗效结果公布，其中仅有4名患者显示出长期的临床益处。这些早期临床试验证实了该手术的技术可行性，但也记录了显著的不良事件，包括硬膜下血肿、感染和细胞过度生长。来自其中几项研究的尸检分析提供了移植物存活的证据，移植物表达了成熟SPNs的标志物并接收了来自宿主大脑的神经支配。然而，移植物内的整合和组织程度常常有限或不正常。尽管一些患者显示出运动、功能或认知评分的适度改善，但在更大的队列中未观察到一致的临床益处，且改善的持续时间是可变的。佛罗伦萨的研究报告了相当比例患者的移植物过度生长，部分移植物甚至侵入皮层。此外，正电子发射断层扫描（PET）和单光子发射计算机断层扫描（SPECT）显示与临床结果的相关性不一致，纹状体中的代谢活性或多巴胺受体D2（DRD2）结合并不能可靠地预测临床改善。

MIG-HD试验是一项多中心随机对照研究，是评估胎儿细胞移植治疗HD的一个里程碑。虽然它未显示出明确的临床益处，但该试验证实了大规模移植的技术可行性，解决了主要的安全问题，并强调了免疫抑制在防止移植物排斥中的关键作用。然而，免疫抑制剂的使用带来了挑战，包括副作用和患者依从性差，并且关于这种治疗的必要性和强度争论持续存在，因为宿主免疫反应存在变异性。尽管一些研究人员认为免疫抑制是必不可少的，但其他人则警告可能适得其反的激进方案。该试验还揭示了更广泛的方法学挑战，例如细胞制备的变异性、不同中心手术实践的差异、阻碍试验连续性的监管延迟，以及需要精心对照的设计来解释安慰剂效应和HD进展的自然异质性。事后分析确定了可能促成令人失望结果的其他因素，包括供体组织质量、移植胎儿的胎龄过大、移植物血管化不足以及尽管进行了免疫抑制治疗仍存在的免疫反应。重要的是，这些发现表明MIG-HD的“失败”是多因素的，而非移植概念本身的反映。该试验为未来研究的设计提供了信息，强调了标准化方案、敏感可靠的结果测量、探索替代细胞来源（如干细胞衍生产品）以及管理多中心物流挑战的策略的必要性。

总之，虽然胎儿组织移植在HD中已被证明在技术上是可行的，并且可以在宿主大脑内导致移植物存活，但支持强大临床疗效的证据仍然有限且不确定。这种变异性可能源于缺乏标准化、样本异质性、递送方法和免疫抑制方案。此外，缺乏可行的胎儿组织冷冻保存方案严重阻碍了严格的质量控制，并排除了移植前对人类白细胞抗原（HLA）相容性的分析。这些问题可能推动了该领域探索替代细胞来源和优化的移植策略。

3.2 当前临床试验

几项正在进行的临床试验正在研究MSCs和自体基质细胞的潜力。目前针对HD研究最深入的干细胞疗法之一是Cellavita HD，这是一种牙髓来源的MSC疗法，通过静脉注射给药。Azidus巴西公司在2017年启动了一项非随机、开放标签的1期临床试验（NCT02728115 / SAVE-DH），旨在评估其在6名有明显HD症状的参与者中的安全性和有效性，参与者接受低或高月剂量，并进行5年随访。测量的结果包括不良事件、统一亨廷顿病评定量表（UHDRS）评分和炎症标志物。此外，一项随机、双盲的2期临床试验（NCT03252535 / ADORE-DH）于2018年开始，旨在研究35名有明显HD症状的参与者对Cellavita HD的剂量反应关系，参与者接受低剂量、高剂量或安慰剂，以UHDRS作为主要结果指标。一项开放标签的扩展2/3期试验（NCT04219241 / ADORE-EXT）尚未开始招募，旨在评估完成ADORE-DH试验的参与者的长期安全性和有效性，参与者在24个月内接受多次剂量，并跟踪各种临床和影像学结果。基于Cellavita HD的研究，一项新的临床试验STAR研究已被设计用于评估NestaCell?的安全性和有效性。该产品是Cellavita的升级版，表达高水平的BDNF，这是一种与HD相关的神经营养因子。STAR研究是一项3期、多中心、前瞻性、随机双盲安慰剂对照临床试验，旨在招募120名HD患者。尽管该3期试验目前尚未招募，但它代表了另一种基于MSC的方法的研究，可能提供增强的再生能力和更广泛的治疗应用。

自体基质细胞疗法也在研究中。Regeneris Medical正在进行一项安全性和有效性临床试验（NCT03297177），涉及300名患有各种神经系统疾病（包括HD）的参与者。这种方法需要重编程突变细胞或分离具有野生型（WT）等位基因的细胞，并得到了在R6/2 HD小鼠模型中阳性临床前数据的支持，该数据显示在双侧纹状体移植自体脂肪来源干细胞后，纹状体细胞凋亡减少、寿命延长、mHTT聚集体减少以及纹状体神经元丢失的调节。这项正在进行的非随机、安慰剂对照研究将评估静脉注射的自体基质细胞与生理盐水相比，在长达5年时间内对神经系统功能变化的安全性。

这些正在进行的临床试验代表了从fNSCs向更实用和伦理上可接受的细胞来源的转变，具有改善HD治疗结果的潜力。

4 开发中的干细胞疗法

4.1 新开发的基于MSC的疗法

除了当前的临床试验，由于MSCs的自我更新能力和释放神经保护因子的能力，且未观察到畸胎瘤或过度生长，它们正在HD动物模型中进行测试。使用YAC128、R6/2和喹啉酸（QA）损伤的HD小鼠模型进行了使用不同类型MSCs的临床前研究。在R6/2小鼠的纹状体内注射脐带和骨髓来源的小鼠MSCs显示改善了空间记忆并减少了神经病理缺陷，但运动障碍未受影响。这些有益效应可能归因于BDNF表达的增加，从而刺激了移植纹状体内源性NSCs的增殖。研究还表明，过表达BDNF的基因工程MSCs可以减少YAC218小鼠的凋亡细胞死亡并减少脑萎缩。在经3-硝基丙酸（3-NP）损伤的HD大鼠中，用脐带来源的人MSCs治疗观察到运动协调性、神经胶质增生减少和纹状体健康状况的阳性结果。在3-NP HD大鼠中全身施用骨髓来源的大鼠MSCs也导致神经和行为缺陷减少，并且存在纹状体神经营养因子，而没有显著的炎症或脑室扩大。

4.2 通过靶向关键发育信号通路进行SPN分化

在纹状体胚胎发育过程中，SPNs起源于LGE，这是腹侧端脑的一个背侧区域，位于形成的皮层下方并与MGE相邻。这种神经元亚型的分化是由一个严格控制的分子信号网络协调的，这些信号在空间和时间上调节TFs的表达。参与前脑背腹和头尾模式化的形态发生素包括转化生长因子-β（TGF-β）家族成员、音猬因子（SHH）、Wnt和成纤维细胞生长因子（FGFs）。利用这一发育框架，研究人员通过操纵关键信号通路，成功设计了将hPSCs导向LGE样NPCs的分化方案。尽管不同方案在时间和分子组合上存在差异，但比较分析揭示了一组反复靶向的通路，这些通路定义了向SPN身份的轨迹。

大多数方案中一个一致的早期步骤是通过双重SMAD抑制诱导神经谱系。这种方法驱动祖细胞走向默认的前脑身份，涉及同时使用小分子（如SB431542（ALK4/5/7抑制剂）和LDN-193189或dorsomorphin（BMP I型受体ALK2、ALK3和ALK6的抑制剂）抑制TGF-β和骨形态发生蛋白（BMP）信号通路。这一策略被确立为将hPSCs导向神经外胚层命运的基础步骤。除了神经诱导外，SMAD2/3活性是获得LGE/纹状体表型所必需的。有报道称，在后期阶段存在TGF-β抑制剂会抑制端脑CTIP2⁺神经元的产生。FGFs也被纳入以增强NSC/NPC的增殖和模式化。例如，FGF2在神经诱导和增殖的早期阶段使用，表明在终末分化前对扩增NSCs/NPCs具有支持作用。

随后的前后模式化通常需要抑制Wnt信号以避免尾侧化并促进腹侧前脑身份。几种方案加入了Wnt拮抗剂，如Dickkopf相关蛋白1（DKK1）、XAV939或IWR1，以使分化偏向端脑命运。SHH信号在沿神经管整个头尾轴产生腹侧细胞类型中也起着关键作用。重组SHH通常以不同浓度添加，而小分子SHH激动剂如purmorphamine和SAG，作为替代方案提供了更化学定义的方法。延长的SHH暴露表明了对正确腹侧模式化的持续需求。尽管许多分化方案使用SHH，但Arber及其同事的工作表明，SHH不是LGE命运的驱动因素（以NOLZ1、FOXP2和CTIP2等TFs为标志），而是参与将NPCs腹侧化为MGE身份（以NKX2.1和LHX8等TFs为特征）。此外，用环巴胺阻断SHH信号对LGE标志物表达没有影响，证明在他们的方案中LGE命运不依赖于SHH信号。

除了这些经典通路，几种其他信号分子在SPN分化中显示出效力。Activin A，TGF-β超家族的一员，已被报道支持LGE样NPCs的诱导。视黄酸（RA）也被用于促进尾侧化和GABA能身份。

在分化后期，神经营养因子和细胞内调节剂被用于支持成熟和功能整合。BDNF是各方案中最一致使用的因子，促进存活和分化。胶质细胞系来源的神经营养因子（GDNF）和胰岛素样生长因子1（IGF1）的共同施用进一步支持成熟和突触发生。

细胞内信号调节剂，如环AMP激动物（二丁酰环AMP（dcAMP）、毛喉素）和组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂（丙戊酸、丙戊酰胺）也被广泛用于促进晚期神经元分化和SPN标志物的表达，可能通过表观遗传和转录调控起作用。特定方案中使用的其他分子包括用于神经成熟的DAPT（一种Notch抑制剂），以及GABA本身以增强功能特性。诸如PD 0332991（一种CDK4/6抑制剂）和CHIR 99021（一种GSK3β抑制剂）等化合物反映了在终末分化阶段微调Wnt和细胞周期信号的持续努力。ROCK抑制剂Y-27632也常被加入以在解离和重铺过程中改善细胞存活和贴附。

总之，从hPSCs分化SPNs依赖于关键发育通路的顺序调节。双重SMAD和Wnt抑制是启动神经诱导和前脑模式化的基础。SHH、Activin A和FGF信号进一步指定腹侧前脑身份并支持祖细胞池的扩增。神经营养因子和细胞内调节剂在后期阶段增强神经元成熟和功能性。最近的方案通过用明确的小分子替代重组蛋白（DKK1、SHH）而日益精细化，提高了目标细胞的产量和纯度。与早期耗时且效率易变的方案不同，当前的策略旨在产生具有更高一致性和可扩展性的临床相关NPCs。

4.3 SPN祖细胞的体外表征和产量

旨在开发CRT的分化方案的成功主要通过其产生所需细胞类型高产量的能力来评估。这些研究的核心目标是衍生出富含LGE样NPCs（旨在作为先进疗法医药产品，ATMP）的同质群体和成熟的SPNs（作为成功终末分化的指标）。尽管纹状体定向祖细胞的衍生已经实现，但产量仍然可变，并且方案在效力、成熟度和纯度之间的平衡上差异很大。比较分析揭示了一系列影响SPN分化发展的趋势和挑战。

形态发生素和小分子的选择、浓度和时机关键决定SPN的产量。早期结合SHH和WNT抑制的方案确立了腹侧特化和成功产生DARPP32⁺/GABA⁺神经元的原则。然而，这些过程常常产生混合群体，包括非纹状体和脱靶的非神经表型。SHH暴露的优化后来使得效率大大提高，高达约75%的神经元获得DARPP32⁺ GABA能身份和功能性。双重SMAD抑制随后成为神经诱导的稳健策略，为高效生成LGE样祖细胞和成熟SPNs奠定了基础。最近，Activin A作为一种替代分化线索出现，能够在没有SHH的情况下诱导LGE样表型，并产生具有强CTIP2、DARPP32表达和与天然纹状体身份一致的电生理特征的SPNs。这些发现表明，不同的发育路径可以汇聚于SPN特化，但在最小化不必要命运的能力上有所不同。

除了形态发生素暴露，分化的结构背景也起着决定性作用。大多数已开发的方法依赖于基质共培养、拟胚体或二维（2D）单层培养。然而，三维（3D）生物材料的引入促进了成熟并增加了具有突触活性的DARPP32⁺/CTIP2⁺神经元的比例。同时，用化学定义的小分子逐步替代重组蛋白提高了重现性和可扩展性，减少了分化时间线并增强了与GMP标准的兼容性。

尽管有这些改进，异质性仍然是一个主要限制。即使是最新的方案也报告存在污染的皮质（TBR1⁺）、中间神经元（生长抑素⁺）或多巴胺能（TH⁺）谱系。此外，在移植阶段经常检测到增殖细胞（Ki67⁺），引发了关于谱系限制不完全的安全担忧。转录组分析进一步表明，尽管CTIP2、DARPP32和钙结合蛋白（CB）等经典标志物持续表达，但晚期纹状体转录程序通常仅部分激活，反映了终末成熟不完全。

功能验证已成为方案评估的关键基准。高效液相色谱（HPLC）、膜片钳记录和钙成像一致证明，hPSC衍生的SPNs释放GABA，产生动作电位，并表现出突触后反应，从而证实了它们在体外的功能能力。

总之，SPN分化已从早期产量适中的基于SHH的方法，发展到化学定义的、临床兼容的、结合双重SMAD抑制、activin A信号和/或先进培养系统的策略。虽然功能验证的SPNs现在可以相对高效地生产，但残留的异质性和不完全的成熟仍然是转化为临床应用的关键障碍。克服这些挑战对于确保SPN祖细胞作为ATMP的安全性、稳定性和治疗潜力至关重要。

4.4 SPN祖细胞在啮齿类动物模型中的临床前评估

体外分化的SPN祖细胞用于CRT的最终验证在于它们移植（PT）到相关动物模型后的表现。临床前啮齿类动物研究在评估这些hPSC衍生群体的存活、成熟和功能整合方面发挥了重要作用。

用于纹状体内NPC移植的两类主要HD模型是：兴奋性毒性QA损伤模型（诱导急性纹状体萎缩但缺乏mHTT表达）和遗传模型（表现出有限的细胞丢失但更好地模拟了疾病的进行性分子病理学）。QA损伤动物仍然是主要范式，而转基因模型的使用频率较低。宿主免疫管理在各研究中有所不同，一些研究组依赖免疫