INSPECTOR研究：基于酶辅助的高信噪比测序技术对循环肿瘤DNA甲基化进行多癌症早期检测方法的临床转化可行性得到了提升

《Cancer Communications》：The INSPECTOR study: enhanced feasibility for clinical translation of a multi-cancer early detection method based on enzyme-assisted high signal-to-noise ratio sequencing of methylated circulating tumor DNA

甲基化检测通过hTET酶辅助的GM-seq技术实现多癌种（8种）早期筛查，覆盖肺癌、乳腺癌等高发癌种，测试灵敏度达81.9%-86.2%，特异性99.0%，并精准溯源癌症组织来源（CSO1准确率87.4%）。研究突破传统bisulfite方法的灵敏度限制，采用靶向甲基化面板设计，结合多中心队列验证，为非侵入性癌症筛查提供新方案。

　　血基DNA（cfDNA）甲基化检测作为一种非侵入性技术，正在成为多种癌症早期检测（MCED）领域的重要工具。这一方法的核心优势在于其无需直接接触肿瘤组织，即可通过血液样本中游离DNA的甲基化特征来识别潜在的癌症信号。与传统的双氢尿嘧啶（BS-seq）技术相比，基于hTET酶辅助的甲基化检测技术（GM-seq）在保持高灵敏度的同时，显著降低了实验噪声，从而提升了对早期癌症信号的识别能力。这种改进对于那些在血液中信号稀疏或难以检测的癌症类型尤为重要，例如乳腺癌、食管癌和胰腺癌等。INSPECTOR研究正是在这一背景下展开，旨在开发一种覆盖多种高发癌症类型的血液检测系统，以提高早期癌症的诊断率并增强临床实用性。

研究团队构建了一个包含6,342个样本的全面甲基化标记数据库，其中整合了来自公共数据集（4,699个样本）和内部样本（1,643个样本）。通过分析这些样本，研究人员筛选出155,362个甲基化CpG位点，并设计出一个靶向检测面板。这种方法利用了hTET酶辅助的全基因组甲基化测序技术，确保了对甲基化信号的精确捕捉，同时通过高深度的下一代测序（NGS）提高了数据的可靠性。在实验过程中，研究团队对不同类型的癌症进行了广泛的验证，包括肺癌、乳腺癌、结直肠癌、肝癌、食管癌、胃癌、胰腺癌和卵巢癌，这些癌症在中国乃至全球范围内均是导致死亡的主要原因之一。

在性能评估方面，研究团队对三个不同阶段的样本进行了测试，包括训练集（1,071例）、验证集（581例）和独立验证集（824例）。结果显示，MCED检测在训练集中达到了99.1%的特异性和83.2%的灵敏度，在验证集中为99.0%和81.8%，在独立验证集中同样保持了较高的性能（99.0%特异性和81.9%灵敏度）。特别值得关注的是，对于I期癌症，MCED检测的灵敏度达到了65.5%，对于II期癌症则提升至79.7%，而I-II期癌症的综合灵敏度为71.3%。这些数据表明，该检测方法在早期癌症识别方面表现出了显著的优势，尤其是对于那些传统方法难以检测的癌症类型。

在癌症信号起源（CSO）预测方面，研究团队构建了一个专门用于识别癌症来源的模型。该模型在验证集中达到了87.9%的Top-1预测准确率，独立验证集中则为87.4%。而在Top-2预测中，准确率分别达到了95.1%和94.5%。对于I期癌症，Top-1预测准确率更是达到了85.5%。这说明，通过甲基化标记的分析，不仅能够有效识别是否存在癌症，还能进一步确定其可能的组织来源，从而为临床诊断提供了更为精确的依据。

此外，研究团队还通过比较不同技术方法的性能，发现GM-seq在转化率和过转化率方面优于BS-seq。GM-seq的转化率中位数为99.1%，而BS-seq的转化率中位数为99.4%。同时，GM-seq的过转化率（非甲基化C的错误转化）显著低于BS-seq（0.4% vs. 2.0%），这表明GM-seq能够更有效地减少实验背景噪声，提高甲基化信号的识别精度。这种技术优势在早期癌症的检测中尤为重要，因为早期癌症的DNA信号往往较弱，需要更高的灵敏度和更低的假阳性率来确保检测结果的可靠性。

在样本处理和数据收集方面，研究团队采用了严格的筛选标准，以确保样本的代表性。对于癌症患者，要求其在采样前30天内被病理确诊，同时排除了妊娠、器官移植、近期输血、接受癌症治疗等可能影响检测结果的干扰因素。对于非癌症参与者，同样设置了详细的排除标准，以确保样本的纯净性。此外，研究团队还特别关注了年龄、性别和病理亚型对检测结果的影响，发现无论是在不同年龄组还是性别组中，该检测方法都表现出了良好的稳定性，特别是在乳腺癌和肺癌的亚型分析中，研究团队发现不同病理亚型对检测结果的影响存在差异，如小细胞肺癌（SCLC）和肺鳞状细胞癌（LUSC）的灵敏度高于肺腺癌（LUAD），这可能与这些癌症类型释放cfDNA的能力有关。

值得注意的是，研究团队在构建甲基化标记数据库时，采用了多步骤的筛选流程。首先，通过比较肿瘤组织和邻近正常组织的甲基化差异，确定了癌症特异性甲基化区域。随后，通过分析白细胞的甲基化数据，排除了那些在正常细胞中普遍存在的甲基化信号。再者，利用内部的GM-seq数据进一步验证了这些标记的有效性，并结合健康个体的cfDNA数据和器官甲基化特征，筛选出具有临床意义的甲基化区域。这一过程确保了所选标记不仅在肿瘤组织中具有显著的甲基化变化，而且在正常组织中几乎不出现，从而提升了检测的特异性。

在癌症信号起源的预测模型中，研究团队采用了基于甲基化信号的多分类逻辑回归方法。该模型在训练集中达到了87.9%的Top-1准确率，而在验证集中为87.4%，在独立验证集中则为87.9%。通过结合癌症类型和性别因素，研究团队对预测结果进行了修正，例如将性别不匹配的癌症类型（如卵巢癌）的得分设为零，并对剩余类型进行归一化处理。这一策略有助于减少因性别差异带来的预测偏差，提高模型的临床适用性。

研究还发现，不同癌症类型的检测灵敏度存在差异。例如，肝癌的检测灵敏度最高，达到了100%，这可能与肝细胞易于释放DNA到血液中有关。而乳腺癌的检测灵敏度在I期为81.8%，在II期则提升至91.7%，这与之前的研究结果一致，表明乳腺癌在血液中的信号随着病情进展而增强。相比之下，胰腺癌的检测灵敏度较低，尤其在I期仅为66.7%，这可能与胰腺癌在血液中信号的稀疏性有关。此外，食管癌的检测灵敏度在I期为79.2%，II期为75.0%，虽然不如肝癌和乳腺癌，但仍然显示出较高的检测能力。

研究团队还评估了该检测方法在不同亚型癌症中的表现，发现其在不同年龄段和性别中均保持了较高的准确率。例如，在年龄小于等于50岁的癌症患者中，检测灵敏度略低于年龄大于50岁的患者，但整体性能仍与以往研究相当。此外，研究团队发现，该方法在检测早期癌症方面具有显著优势，尤其是在那些缺乏标准化筛查手段的癌症类型中，如食管癌、胰腺癌和卵巢癌，其检测灵敏度均超过了传统方法的水平。

尽管研究结果令人鼓舞，但该研究也存在一些局限性。首先，参与者的样本以无症状个体为主，仅少数患者存在与癌症相关的良性病变，这可能影响模型在高风险人群中的泛化能力。其次，研究仅涵盖了8种癌症类型，未包括前列腺癌、尿路上皮癌等其他重要癌症类型，因此在临床应用中仍有扩展空间。此外，对于健康参与者，研究团队仅进行了12个月的随访，未能提供长期的非癌症状态评估，同时也没有对阳性或阴性癌症病例进行生存随访。因此，未来需要进行更大规模的前瞻性研究，以进一步验证该检测方法的准确性和临床适用性。

总体而言，该研究展示了基于cfDNA甲基化检测的MCED和CSO模型在临床应用中的潜力。通过整合多种数据来源，并采用先进的hTET酶辅助测序技术，该方法在保持高特异性的同时，显著提升了对早期癌症的检测灵敏度。此外，其在癌症信号起源预测方面也表现出色，能够准确识别肿瘤的组织来源。这些发现为开发更高效、更安全的非侵入性癌症筛查工具提供了坚实的基础，并为未来的癌症早筛研究和临床实践提供了重要的参考。