针对含有Jumonji-C结构域的蛋白质6的抑制剂支架的构型研究

《ChemMedChem》：Profiling Inhibitor Scaffolds for the Cancer Target Jumonji-C Domain-Containing Protein 6

该研究开发了基于固相萃取-质谱联用（SPE–MS）的高通量JMJD6催化抑制分析方法，评估了WL12、SKLB325和Compound 7p等现有抑制剂的实际效果，发现其抑制效率低于预期。临床使用的PHD抑制剂Enarodustat和Desidustat表现出高效JMJD6抑制活性（IC50分别为1.2和2.7 μM），而WL12甚至未显示抑制效果。通过计算化学优化得到的新化合物Compound 10a的IC50达0.07 μM，为开发高选择性JMJD6抑制剂提供了新方向。研究还发现，现有PHD抑制剂可能因非特异性抑制JMJD6而产生潜在副作用，提示需结合SPE–MS方法进行临床前筛选。

　　### 研究背景与意义

Jumonji-C domain-containing protein 6（JMJD6）是一种依赖2-氧代戊二酸（2OG）和铁离子（Fe(II)）的酶，它能够催化多种蛋白质中的赖氨酸残基在C-5位发生羟基化反应。这种酶在多种生物学过程中起着重要作用，包括转录调控、剪接、缺氧感应、造血以及胚胎发育等。然而，其异常表达或催化活性与肿瘤的发生和进展密切相关，尤其是它在前列腺癌中促进雄激素受体剪接变体7（AR-V7）的生成，而AR-V7已被证实是抗雄激素药物耐受性的关键因素。因此，JMJD6被认为是一个具有治疗潜力的癌症靶点。

尽管JMJD6在癌症治疗中展现出重要价值，但目前报道的针对JMJD6的小分子抑制剂数量仍然有限。这在一定程度上归因于缺乏高效的、适用于纯化JMJD6的抑制活性筛选方法。现有的研究中，大多数对JMJD6的抑制活性评估依赖于基于固相萃取（SPE）和质谱（MS）的高通量筛选方法，然而这些方法的效率和选择性仍有待提高。此外，一些临床应用的抑制其他2OG依赖性氧合酶（如缺氧诱导因子-α脯氨酰羟化酶结构域蛋白，PHD）的小分子药物，例如Enarodustat和Desidustat，已被发现能够有效抑制JMJD6的活性，这提示我们可能需要重新评估这些药物在临床使用中的潜在副作用。

### 研究方法与技术

为了提高对JMJD6的抑制活性评估效率，本研究开发了一种基于固相萃取和质谱的高通量抑制活性筛选方法（SPE–MS）。该方法利用了2OG依赖性氧合酶的特异性反应，通过检测底物（如来自溴结构域蛋白4的511–550肽段）在酶催化作用下的羟基化产物来评估抑制效果。该方法具有高灵敏度、低试剂消耗量以及可半自动化的优点，适用于大规模的化合物筛选和结构优化研究。

实验中使用的SPE–MS方法在优化条件下能够有效监测JMJD6对BRD4_511–550的羟基化反应。研究发现，在0.05 μM的JMJD6浓度、1 μM的底物浓度、2 μM的Fe(II)浓度以及100 μM的2OG浓度下，反应的单羟基化产物占主导地位。此外，通过调整反应时间，研究人员能够确保实验处于稳态条件下，从而提高数据的准确性和可重复性。

为了进一步验证该方法的有效性，研究人员还对一些已知的2OG依赖性氧合酶抑制剂（如2,4-PDCA、IOX1、SKLB325、Compound 7p、WL12等）进行了测试，并对它们的抑制效果进行了比较。实验结果显示，尽管这些化合物在某些研究中被报道具有一定的抑制活性，但在本研究的SPE–MS条件下，它们的抑制效率普遍较低，这提示我们可能需要重新评估它们在细胞水平上的实际作用机制。同时，研究人员还对一些临床使用的PHD抑制剂（如Enarodustat、Desidustat等）进行了测试，发现它们在本研究的SPE–MS条件下对JMJD6具有较高的抑制效率，这为研究这些药物的潜在副作用提供了重要线索。

### 研究发现与分析

在本研究中，研究人员发现多个已知的2OG依赖性氧合酶抑制剂对JMJD6的抑制效果不理想。例如，WL12在之前的研究中被报道对JMJD6的催化反应具有较强的抑制活性，但本研究显示其在SPE–MS条件下对JMJD6的抑制效率较低，甚至未表现出明显的抑制作用。这表明，WL12的抑制活性可能与其在体外实验中的反应条件有关，也可能由于其在细胞内发生代谢变化而表现出不同的作用机制。

同样，SKLB325和Compound 7p虽然在某些实验中表现出较高的抑制活性，但它们在SPE–MS条件下的抑制效率较低，这可能与其化学结构中的某些不稳定基团有关。此外，研究人员还发现，某些PHD抑制剂（如Enarodustat和Desidustat）对JMJD6的抑制效果较好，这可能意味着这些药物在临床使用中存在对JMJD6的非靶向抑制作用，这可能影响其在治疗其他疾病（如慢性肾病相关性贫血）中的安全性和有效性。

通过分子对接模拟，研究人员进一步探讨了这些化合物与JMJD6的结合模式。结果表明，这些抑制剂可能通过竞争性结合2OG的活性位点来抑制JMJD6的催化活性。其中，Compound 10a被发现是目前最具潜力的JMJD6抑制剂之一，其对JMJD6的抑制效率远高于其他化合物。此外，一些化合物（如BNS和Compound 34）也被预测能够有效结合JMJD6的活性位点，这为未来的结构优化提供了新的思路。

### 研究意义与未来展望

本研究的结果不仅揭示了现有抑制剂在体外条件下的抑制效率差异，还为开发更高效、更特异的JMJD6抑制剂提供了重要依据。此外，研究还指出了一些临床使用的PHD抑制剂可能对JMJD6产生非靶向抑制作用，这可能影响其在治疗其他疾病时的安全性。因此，未来在开发新的2OG依赖性氧合酶抑制剂时，需要考虑其对JMJD6的潜在影响，并通过更精确的筛选方法（如SPE–MS）来评估其选择性和有效性。

本研究开发的SPE–MS方法为JMJD6抑制剂的筛选和优化提供了新的工具，具有较高的通量和灵敏度。该方法能够减少酶和底物的消耗，同时确保实验数据的准确性和可重复性。此外，该方法还为研究其他2OG依赖性氧合酶的抑制活性提供了参考，有助于进一步理解这些酶在疾病中的作用机制。

总之，本研究不仅为JMJD6抑制剂的开发提供了重要的实验依据，还揭示了某些临床药物可能对JMJD6产生非靶向抑制作用，这为未来药物的安全性和有效性评估提供了新的视角。