拉福拉病基因治疗的进展：通过静脉注射重组腺相关病毒介导EPM2A和EPM2B基因的输送

《Clinical and Translational Medicine》：Advances in gene therapy for Lafora disease: Intravenous recombinant adeno-associated virus-mediated delivery of EPM2A and EPM2B genes

Lafora病是由EPM2A或EPM2B基因突变导致的神经退行性疾病，特征为Lafora小体积累和神经元过度兴奋。本研究采用AAV9P31载体通过静脉注射递送EPM2A或EPM2B基因至1月龄Lafora病小鼠模型，结果显示基因治疗有效逆转了运动协调障碍、认知缺陷和神经元兴奋性异常，并显著减少Lafora小体形成，且未观察到肝毒性或免疫反应。该研究验证了静脉注射AAV载体在早期干预中的可行性和安全性。

　　Lafora病是一种罕见且致命的进行性肌阵挛性癫痫，通常在儿童晚期发作，表现为癫痫发作、进行性神经功能退化以及严重的认知能力下降。这种疾病主要由EPM2A或EPM2B基因的突变引起，这两个基因编码的蛋白质分别是laforin和malin，它们共同形成一个复合体，调控糖原代谢并减轻细胞应激。在EPM2A或EPM2B功能丧失的情况下，会引发Lafora体（LBs）的异常积累，这些Lafora体是由聚糖（polyglucosan）组成的不溶性、结构不规则且高度磷酸化的糖原，与相关蛋白结合，最终导致神经退行性病变。

在本研究中，我们采用了一种更为温和且侵入性较低的治疗策略，即通过静脉注射（IV）的方式，使用rAAV2/9P31载体携带EPM2A或EPM2B基因，以改善神经功能和减轻疾病症状。这种方法相比传统的脑室内注射（ICV）更为安全，并且能够有效跨越血脑屏障（BBB），从而实现对中枢神经系统（CNS）的广泛治疗。我们选择了在疾病早期阶段进行基因治疗，以期达到最佳的治疗效果。

为了评估这种方法的可行性，我们首先通过rAAV2/9P31-GFP载体确认了其在CNS中的广泛分布能力。在1个月大的小鼠中进行单次静脉注射后，5个月时在小鼠的大脑中观察到了GFP蛋白的表达，包括小脑、纹状体、嗅球、皮层、海马体以及脊髓等部位。此外，GFP蛋白在肺、肝、心脏和股四头肌等周围组织中也有所表达，这表明rAAV2/9P31载体不仅在中枢神经系统中具有良好的靶向性，还能够在全身范围内发挥作用。

接下来，我们评估了基因治疗对小鼠行为和神经功能的影响。通过使用旋转杆测试（rotarod test）评估小鼠的运动协调能力，结果显示Epm2a?/?和Epm2b?/?小鼠在接受静脉注射rAAV2/9P31-hEPM2A或rAAV2/9P31-hEPM2B后，其运动协调能力显著改善，接近正常小鼠的水平。此外，通过对象识别任务（ORT）评估记忆功能，治疗组小鼠的识别指数显著提高，表明基因治疗在改善认知功能方面具有潜在价值。

为了进一步研究基因治疗对神经元兴奋性的影响，我们使用了戊四氮（PTZ）进行测试，这是一种能够诱发癫痫样活动的化学物质。结果显示，接受治疗的小鼠在PTZ刺激下表现出更少的肌阵挛发作，这表明基因治疗在减少癫痫样活动方面具有积极效果。这一发现进一步支持了静脉注射rAAV2/9P31载体作为治疗Lafora病的潜在策略。

在神经生理学方面，我们对纹状体和海马体进行了深入研究。纹状体的中等棘突神经元（MSNs）在基因治疗后表现出正常的膜电生理特性，包括膜电容、膜电阻和静息膜电位的恢复。同时，我们还观察到了基因治疗对突触传递和长时程增强（LTP）的恢复效果。LTP是神经可塑性的关键指标，而Lafora病患者的神经元通常表现出LTP的缺陷。通过静脉注射rAAV2/9P31-hEPM2A或rAAV2/9P31-hEPM2B，我们成功恢复了纹状体和海马体中MSNs的LTP，这表明基因治疗在恢复神经网络功能方面具有重要意义。

此外，我们还评估了基因治疗对Lafora体形成的影响。在海马体的CA1和CA2-CA3区域，以及感觉运动皮层的IV-V层，接受治疗的小鼠中Lafora体的数量显著减少。这表明基因治疗不仅能够恢复神经元功能，还能有效阻止Lafora体的积累，从而延缓神经退行性病变的发生。

为了确保治疗的安全性，我们还评估了基因治疗对肝脏功能和免疫系统的影响。通过肝组织的病理学分析和生化参数检测，我们发现治疗组小鼠的肝脏组织没有出现明显的炎症或肝细胞肿大，且血清中的肝功能指标（如ALT、AST和ALP）也保持在正常范围内。此外，通过检测IgG和IgM水平，我们未发现免疫系统的显著激活，这表明静脉注射rAAV2/9P31载体在治疗过程中是安全的。

本研究的发现支持静脉注射rAAV2/9P31载体作为Lafora病的潜在治疗策略。这种疗法不仅能够有效恢复神经元功能和神经网络的正常活动，还能减少Lafora体的形成和神经胶质细胞的激活，同时表现出良好的安全性和低毒性。尽管在某些行为和组织学检测中，某些组别的差异未达到统计学显著性，但这些趋势仍然表明了基因治疗在临床转化中的广阔前景。

我们还发现，静脉注射rAAV2/9P31载体在治疗效果上与传统的脑室内注射方法相当，甚至在某些方面表现更优。这为Lafora病的治疗提供了一种更安全、更便捷的方法，特别是在疾病早期进行干预时，可能带来更显著的治疗效果。此外，rAAV2/9P31载体在全身组织中的广泛分布，也表明其在治疗其他神经系统疾病时可能具有更高的应用潜力。

本研究的结论表明，基因治疗在Lafora病的治疗中展现出巨大的前景。静脉注射rAAV2/9P31载体不仅能够恢复神经元功能，改善神经网络的异常，还能有效减少Lafora体的形成，降低神经胶质细胞的激活，并表现出良好的安全性和耐受性。这些结果为Lafora病的临床治疗提供了重要的科学依据，也为其他神经系统疾病的基因治疗策略提供了新的思路。

本研究的贡献者包括多位研究人员，他们在概念设计、数据收集、分析和撰写过程中发挥了重要作用。同时，我们也感谢所有提供技术支持和资源的机构，他们的贡献对于本研究的顺利完成至关重要。本研究得到了多个基金会和研究计划的支持，为后续的临床研究奠定了坚实的基础。

总之，静脉注射rAAV2/9P31载体作为一种基因治疗策略，不仅具有较低的侵入性和较高的安全性，还能够有效恢复Lafora病小鼠的神经功能，减少Lafora体的形成，并改善行为表现。这一研究为Lafora病的治疗提供了新的方法，同时也为基因治疗在神经系统疾病中的应用提供了重要的参考。