利用液滴微流控技术实现的高通量通用单实体测序

《iMeta》：High-throughput generic single-entity sequencing using droplet microfluidics

单细胞测序技术革新微生物组学研究，GSE-Seq平台通过微流控技术实现单病毒/细菌基因组的高效捕获与完整组装，突破传统方法在裂解效率、文库制备和长读测序整合上的瓶颈，成功解析人类粪便和海洋沉积物中数万种病毒及细菌基因组，揭示大量未培养微生物的遗传特征与多样性。

　　近年来，随着单细胞测序技术的快速发展，科学家们对细胞异质性的理解取得了重大突破。这项技术原本主要用于研究哺乳动物细胞，但其应用范围逐渐扩展到其他微生物，如病毒和细菌等。然而，现有的单细胞测序平台在处理这些微生物时仍然存在诸多局限性，包括低通量、低效的裂解方法以及高度破碎的基因组等问题。为了解决这些问题，研究人员开发了一种名为GSE-Seq的新方法，该方法结合了多种先进的技术手段，实现了对多种单生物实体的高效、高通量测序。

GSE-Seq的核心在于其独特的集成流程，它能够以高分辨率解析微生物的基因组信息。首先，通过微流控技术生成大量单克隆条形码，这些条形码能够为每个生物实体提供唯一的标识。接着，利用可降解的水凝胶进行在位裂解和全基因组扩增（WGA），这一过程不仅提高了裂解效率，还确保了基因组的完整性。随后，通过在微滴中进行DNA片段化和末端修复，为后续的条形码连接做准备。最后，将带有条形码的DNA片段进行合并，并通过长读长测序技术（如PacBio）获取高质量的基因组序列。

这一方法的创新之处在于其对条形码生成和使用方式的优化。传统的条形码生成方法通常依赖于复杂的合成过程，而GSE-Seq采用了一步式微滴PCR技术，使得生成超过十亿种条形码成为可能。这种条形码不仅具有高度的随机性，还能在极低的错误率下确保每个生物实体都能被准确识别。此外，通过将DNA片段与条形码结合，研究人员能够在后续的分析中将每个片段归因于其原始的生物实体，从而提升基因组重建的准确性和完整性。

GSE-Seq的应用验证了其在处理复杂样本方面的强大能力。通过分析来自人类粪便和海洋沉积物的样本，研究人员成功地从这些样本中获得了数千个高质量的单实体基因组，其中大部分是前所未见的新型病毒和细菌。在病毒方面，GSE-Seq不仅能够识别双链DNA病毒（dsDNA）和单链DNA病毒（ssDNA），还能有效检测到难以发现的巨型病毒和crAss噬菌体。对于细菌，GSE-Seq同样表现出色，揭示了潜在的新物种，并验证了其在不同微生物界中的广泛适用性。

在基因组组装方面，GSE-Seq通过在单细胞水平上对测序数据进行条形码划分，显著提高了基因组组装的效率和质量。与传统的直接组装（DA）方法相比，条形码集群组装（BCA）和单实体基因组聚类（SAGb）策略能够生成更长的基因组片段，并提高基因组的完整性。这一能力对于解析复杂微生物群落中的基因组至关重要，因为传统方法往往无法准确区分不同菌株或处理难以组装的基因组。

此外，GSE-Seq还展现了其在探索微生物多样性方面的潜力。通过对人类肠道和海洋沉积物样本的分析，研究人员发现了一大比例的新型病毒，这些病毒在现有的数据库中没有记录，被称为“病毒暗物质”。这表明，GSE-Seq不仅能够有效捕捉微生物的多样性，还能揭示那些在传统方法中难以发现的物种。例如，该技术成功地识别了具有复杂基因组结构的巨型病毒，以及难以通过常规方法检测的crAss噬菌体，这些发现对于理解病毒与宿主之间的相互作用具有重要意义。

GSE-Seq在细菌基因组分析中也表现出色。通过处理来自健康捐赠者的粪便样本，研究人员获得了超过23,000个细菌单扩增基因组（bSAGs），其中一部分被分类为新型物种。这不仅反映了人类肠道微生物的多样性，也说明了GSE-Seq在处理具有坚硬细胞壁的细菌方面的优势。同时，该技术还能够准确识别细菌与噬菌体之间的相互作用，这对研究噬菌体疗法和微生物群落与免疫系统的相互作用提供了重要的工具。

在方法论上，GSE-Seq采用了多种技术的集成，包括微流控技术、可降解水凝胶处理、条形码引导的基因组组装以及长读长测序。这些技术的结合使得GSE-Seq能够克服传统方法的瓶颈，如低通量、低效的裂解过程和不完整的基因组组装。通过优化条形码生成和基因组扩增的步骤，GSE-Seq显著提高了测序效率和数据质量，为高通量单细胞基因组研究提供了新的解决方案。

尽管GSE-Seq已经展现出卓越的性能，但研究人员也意识到还有进一步优化的空间。例如，对于细菌样本的分析，可以考虑使用更精确的基因组扩增方法，如初级模板引导的扩增（primary template-directed amplification）或通过转座子插入进行线性扩增（LIANTI）。此外，为了全面评估GSE-Seq在复杂样本中的回收偏差，还需要与传统的宏基因组测序方法进行直接定量比较。未来的研究可能会探索GSE-Seq在其他微生物群体中的应用，如古菌和真核生物，从而进一步拓展其研究范围。

总的来说，GSE-Seq的推出标志着单细胞测序技术的一个重要进展。它不仅解决了传统方法在处理微生物时的诸多限制，还为研究微生物多样性、基因组组装以及宿主-病毒相互作用提供了强有力的支持。随着技术的不断优化和完善，GSE-Seq有望成为探索微生物世界的重要工具，推动对生物多样性和生态功能的深入理解。