综述：iPSC来源的视网膜类器官在遗传性视网膜疾病研究中的进展

《Orphanet Journal of Rare Diseases》：Progress of iPSC-derived retinal organoids in the study of inherited retinal diseases

本综述系统阐述了诱导多肽干细胞（iPSC）来源的视网膜类器官（ROs）作为疾病模型在视网膜母细胞瘤（RB）、视网膜色素变性（RP）、莱伯先天性黑蒙（LCA）及X连锁青少年视网膜劈裂症（XLRS）等遗传性视网膜疾病（IRDs）研究中的应用，强调了ROs在模拟体内视网膜发育过程、探索疾病机制及药物筛选方面的巨大潜力，为IRDs的精准治疗提供了新视角。

　　

引言

遗传性视网膜疾病（IRDs）是一组具有显著遗传异质性的复杂罕见疾病，与超过280个致病基因相关，全球预计有550万人受累。这类疾病常导致光感受器细胞变性，引起严重视力损伤。IRDs研究和治疗的主要挑战在于缺乏合适的临床前模型来探究其发病机制和评估潜在治疗策略。近年来，视网膜类器官（ROs）培养技术的进展为IRDs研究提供了新的希望。

RO发育：重演体内视网膜发生过程

视网膜的结构与发育

在早期胚胎发育中，视网膜由神经外胚层形成。外胚层形成两个视泡（OVs），其远端部分内折形成视杯。视杯的外壁和内壁分别产生视网膜色素上皮（RPE）和神经视网膜（NR）。神经视网膜是一个分层结构，由三种视网膜核层和两个中间突触丛状层构成。视网膜发育过程是连续但重叠的，分为早期和晚期两个阶段。视网膜的功能是检测外部世界的视觉信息，并将光信号转换为化学信号传递至大脑皮层成像。

视网膜类器官的分化过程

视网膜类器官的分化类似于视泡的形成过程，可大致分为三个 distinct 阶段。第一阶段（分化第30至50天），类器官表现出明确的、明亮的外层神经上皮边缘，充满神经视网膜祖细胞（NPCs）和视网膜神经节细胞（RGCs）。第二阶段（约第80至120天），类器官形成暗相核心，同时早期视锥和视杆光感受器祖细胞开始出现。第三阶段（约第120至180天），外层边缘的显著性增强，光感受器结构开始分化。研究表明，ROs能够模拟人眼发育的早期阶段和人类视网膜疾病的发病，其层状结构可显示人类特异性特征。

视网膜类器官的光转导

ROs包含了所有主要的视网膜细胞类型，它们重演了体内视网膜发生的“前脑-视泡-视杯”序列，并显示出与天然视网膜相似的分层结构。更重要的是，ROs具有与体内视网膜相似的生理功能，能够复制光转导级联反应和突触连接。作为研究视网膜发育和疾病的工具，ROs必须表现出几种特定特性才能引发功能性光反应。研究已通过全细胞膜片钳技术证实了ROs来源的光感受器中存在成熟功能的环核苷酸门控（CNG）通道和超极化激活的环核苷酸调节（HCN）通道，并且钙成像技术可视化显示了源自光感受器层、内核层和神经节细胞层细胞的光反应。

iPSC-ROs的衍生与培养

3D及2D/3D结合培养模型

过去的RO培养系统主要分为两类：3D模型以及2D和3D结合模型。关键区别在于拟胚体（EB）阶段。3D培养系统从EB阶段开始，随后是视泡和视杯阶段。而2D/3D培养系统则绕过EB阶段，从贴壁的视网膜细胞直接产生视泡阶段。随后的研究对培养条件进行了进一步优化，例如通过调节TGF-β和Sonic hedgehog信号通路预处理hPSCs初始状态，以及适时添加BMP4和IGF-1等，以促进视泡形成和分层。为了满足临床转化的需求，研究人员还开发了在完全确定的、无外源成分和无饲养层条件下生成可储存ROs的简单方法。

优势与挑战

与简单的3D培养模型相比，2D和3D结合的培养方法通常能更有效地组织并成熟为呈现分层视网膜形态的高级类器官。该衍生系统重演了体内视网膜发育的每个主要步骤。然而，精确分离视泡样结构对于ROs的分化和成熟至关重要，目前这仍然是一项劳动密集型且耗时的任务，需要大量的练习和训练。有研究描述了一种使用细胞刮刀刮下整个贴壁培养物，然后在悬浮条件下培养细胞团块的替代方法，为提高RO分化效率提供了新思路。

iPSC-ROs在IRD建模中的应用

构建视网膜的3D类器官疾病模型能更好地模拟组织细胞与基质间的相互作用、细胞迁移等，为探索目前无法治愈的视网膜疾病的机制和评估潜在疗法提供了有前景的工具。

视网膜色素变性（RP）

RP是最常见的IRD，发病率约为1/4000。目前已知约70种基因突变可引发RP，包括USH2A、RPGR、RHO等。利用源自USH2A突变RP患者的iPSC培养的多层视网膜类器官显示，早期类器官在形态学、免疫荧光染色和转录谱方面存在显著缺陷。源自RHO突变患者的特异性ROs则表现出光感受器发育受阻、内质网应激诱导的视杆细胞凋亡增加以及视杆光感受器的进行性丧失。

视网膜母细胞瘤（Rb）

Rb是儿童中最常见的眼内恶性肿瘤。RB1基因的双等位基因失活是96%病例的致病因素。使用患者来源的RB1突变iPSC诱导的ROs作为疾病模型，研究表明pRB耗竭的视网膜类器官表现出类似于Rb肿瘤的特征。单细胞RNA测序证实，视网膜祖细胞是RB-RO中最普遍的细胞类型。此外，对患者iPSCs进行二次突变可导致RO中产生Rb肿瘤，证实了Knudson的“二次打击”假说。

莱伯先天性黑蒙（LCA）

LCA是一种严重的致盲性遗传性视网膜疾病，约占遗传性视网膜变性的5%。CEP290基因突变占所有LCA的20-25%，是最常见的原因。源自CEP290-LCA患者的视网膜类器官显示出纤毛发生异常，有效地再现了LCA的发病机制。利用CRISPR/Cas9技术建立NMNAT1基因敲除的hiPSCs的研究则揭示了NMNAT1在人类视网膜谱系分化中的关键作用。

X连锁青少年视网膜劈裂症（XLRS）

XLRS是一种相对常见的早发性中央视网膜变性疾病，其特征性的视网膜劈裂表型而得名。RS1基因编码的视网膜劈裂蛋白（retinoschisin）功能异常是其主要病因。研究人员从XLRS患者生成iPSCs并建立3D ROs用于疾病研究，发现XLRS-RO模型复制了患者的关键病理特征。CRISPR/Cas9基因校正可使RS1分泌和视网膜发育正常化。针对RS1热点突变c.214G>A（p.E72K）的研究表明，突变型hiPSCs衍生的ROs表现出光感受器发育延迟等表型，并可被RS1基因增强疗法部分挽救。XLRS-ROs还揭示了由于RS1缺陷导致的Na/K-ATPase失调和ERK信号通路活性增加。

结论

视网膜类器官是在hPSCs基础上发展起来的3D细胞聚集体，能有效模拟人类视网膜的发育阶段和特征。这些ROs在视网膜发育研究、视网膜疾病模拟和药物筛选中展现出巨大潜力。随着生成方法的不断优化，其生成效率和可重复性得到提高，类器官间的差异得以最小化。总体而言，视网膜类器官技术是一个不断发展的领域，它为视网膜研究提供了新的工具和平台，有望在未来为视网膜疾病患者带来更有效的治疗选择。