揭示一种新型噬菌体与Xanthomonas hortorum pv. vitians之间的相互作用及其进化限制

《Environmental Microbiology Reports》：Unveiling Host Interactions and Evolutionary Constraints of a Novel Bacteriophage Infecting Xanthomonas hortorum pv. vitians

噬菌体ΦXhv-1通过识别Xanthomonas hortorum pv. vitians的LPS O-抗原侧链介导感染，通过Tn-seq筛选出36个关键基因，涉及LPS生物合成。突变体显示噬菌体抗性与毒力下降的权衡，验证了LPS在宿主互作中的核心作用，为可持续噬菌体生物防控提供理论依据。

　　植物病原细菌正在对全球农作物生产构成威胁，尤其是在疾病管理策略有限和气候变化影响加剧的背景下。其中，引起生菜细菌性叶斑病的细菌 *Xanthomonas hortorum* pv. *vitians* 由于缺乏高效的控制手段，其管理难度较高。为应对这一挑战，噬菌体（phage）作为一种生物控制手段正在受到越来越多的关注。然而，其长期有效性依赖于对噬菌体与宿主细菌之间相互作用的深入理解，以及细菌对噬菌体产生抗性的潜在发展。本研究中，我们从法国蒙彼利埃的污水处理厂中分离并表征了一种新的裂解性噬菌体 ΦXhv-1，该噬菌体定义了一个新的类 *Caudoviricetes* 属。通过转座子插入测序技术，我们确定了36个对噬菌体易感性至关重要的细菌基因，这些基因主要参与脂多糖（LPS）生物合成和表面多糖修饰。通过靶向诱变和荧光显微镜检查，我们确认了 ΦXhv-1 会吸附在LPS O-抗原侧链的特定残基上。对噬菌体抗性突变株的检测显示，它们在体外表现出减少的运动能力，并且在植株中表现出显著降低的致病性。这些发现揭示了噬菌体抗性与细菌适应性之间的一种进化权衡，表明在田间环境中，抗性的发展可能受到自然限制。本研究为 *X. hortorum* pv. *vitians* 与噬菌体的相互作用提供了新的见解，并支持开发可持续的噬菌体生物控制策略以应对生菜细菌性叶斑病。

随着气候变化的加剧，植物病害和害虫对农作物造成的损失预计将更加严重，同时食品安全问题也日益引起关注。因此，迫切需要开发新的基于生物控制的综合植物保护策略。在主要的植物病原细菌属中，*Xanthomonas* 属的细菌可以感染几乎400种植物物种，其中一些是全球重要的经济作物，如水稻、番茄和甘蓝。这些病原菌在植物病害中扮演着重要角色，其中 *Xanthomonas hortorum* pv. *vitians* 是一种重要的生菜叶部病原菌，导致细菌性叶斑病。这种病害在全球范围内广泛存在，影响所有类型的生菜种植（Koike and Gilbertson, 2017）。由于缺乏有效的病害控制或预防手段，该病原菌已成为生菜生产的严重威胁（Bull and Koike, 2005）。为了应对这一问题，已有研究探索了 *Pseudomonas* 属菌株和 *Origanum* 属植物精油的生物控制潜力，这些方法在体外表现出显著的抗菌活性，并支持开发可持续和环保的保护生菜作物的手段。此外，关于 *X. hortorum* pv. *vitians* 的遗传多样性、其适应宿主植物的分子机制以及驱动病原性的关键因素的研究也在推动这些控制策略的发展（Fayette et al., 2016; Rosenthal et al., 2022; Morinière et al., 2020）。

裂解性噬菌体（lytic bacteriophages）被认为是潜在的替代杀菌剂，因为它们具有极高的宿主特异性、自我复制能力、可生物降解性以及对非目标生物无毒性（Vila et al., 2024）。此外，噬菌体作为 *Xanthomonas* spp. 的生物控制剂在温室和田间条件下均显示出有希望的控制效果（Nakayinga et al., 2021; Holtappels et al., 2022）。因此，针对 *X. hortorum* pv. *vitians* 的新型噬菌体候选物的分离和表征可能为开发有效的生物控制方案提供新的机会（Boyer et al., 2022）。然而，评估这种噬菌体疗法的长期有效性需要解决细菌抗性可能产生的问题，这是噬菌体和细菌在共同进化过程中自然发生的现象。在噬菌体感染过程中，关键的一步是噬菌体颗粒与细菌细胞表面特定受体的初始结合，随后是不可逆的吸附，从而使得噬菌体的基因组材料可以注入宿主细胞。这些细菌的分子靶点包括外膜蛋白、荚膜多糖、脂多糖（LPS）和其他细菌细胞附属结构，如鞭毛和菌毛（Bertozzi Silva et al., 2016）。通过对这些表面受体的突变，可以导致吸附失败，从而产生细菌抗性。因此，了解细菌感染噬菌体所需的分子靶点对于开发有效且可持续的生物控制策略至关重要。在这一背景下，转座子插入测序（Tn-seq）作为一种强大的基因组方法，已被用于识别噬菌体易感性决定因子（Mutalik et al., 2020）。虽然目前尚未在任何已知的 *X. hortorum* 菌株中研究过噬菌体受体，但一项在 *Xanthomonas campestris* pv. *campestris* 中的研究使用了转座子插入（Tn5）库，发现 *wxc* 基因簇与两个新鉴定的裂解性噬菌体有关（Holtappels et al., 2022）。由于LPS在致病性中起关键作用，抗性突变往往伴随着权衡。在 *Xanthomonas campestris* pv. *campestris* 中，*wxc* 集群中的突变赋予了对噬菌体 FoX2 和 FoX6 的抗性，同时也显著降低了其在植株中的致病性。在 *Dickeya solani* 中，自发的噬菌体抗性突变株在马铃薯上的适应性和致病性也显著降低（Warring et al., 2022）。这些例子突显了表征细菌表面结构作为噬菌体受体的重要性，以及抗性机制如何影响生态性能和病原性。

本研究中，我们从法国蒙彼利埃的污水处理厂中分离并表征了裂解性噬菌体 ΦXhv-1，该噬菌体定义了一个新的类 *Caudoviricetes* 属。为了研究宿主分子决定因子，我们通过与噬菌体共培养的方式，利用之前生成的转座子插入测序库（Morinière et al., 2019）进行了竞争适应性实验。通过全基因组范围的抗性位点识别，我们进一步通过选择高适应性敲除突变株和针对功能区域的靶向删除诱变，验证了这些位点。结合这些突变株的见解以及荧光显微镜观察噬菌体吸附情况，我们精准地识别了细菌的分子靶点，并提出了一个关于 ΦXhv-1 吸附的理论模型。最后，我们评估了抗性突变对细菌适应性和致病性的影响，重点关注症状发展、组织定殖和运动能力。这些发现为噬菌体与宿主的相互作用提供了新的见解，并支持针对生菜细菌性叶斑病的可持续噬菌体生物控制策略的发展。

本研究采用了一系列实验方法，以深入了解噬菌体 ΦXhv-1 与 *X. hortorum* pv. *vitians* 之间的相互作用。首先，我们通过一种基于富集的方法从污水处理厂的样本中分离出 ΦXhv-1，并通过双层琼脂技术筛选出裂解性噬菌体。随后，我们通过透射电子显微镜（TEM）对噬菌体的形态进行了表征，发现其具有典型的 *myovirus* 形态，包括一个非收缩的长尾和一个二十面体的衣壳。TEM 图像显示，噬菌体的平均直径为54.45 ± 0.65 nm，长尾的平均长度为86.35 ± 1.26 nm，宽度为14.89 ± 0.37 nm。这些数据表明 ΦXhv-1 具有 *myovirus* 的典型结构特征。我们还对噬菌体的基因组进行了全基因组测序，发现其为46,109 bp的双链DNA，GC含量为62%（GenBank accession: PV408261）。基因注释结果显示，有68个编码域序列（CDSs），其中33个被功能注释，35个则为假定或未知功能。这些CDSs被分为四个功能组：（i）裂解，（ii）结构蛋白，（iii）DNA包装，（iv）DNA复制和核酸代谢。值得注意的是，未检测到已知的毒力/毒素、抗生素抗性或与温和生活方式相关的基因。这些结果与预测的裂解性生活方式一致，其预测概率为77.5%。BLAST分析的最佳匹配对应于感染 *Xanthomonas* spp. 的噬菌体，其中与 ΦXhv-1 最接近的噬菌体是 BsXeu269p/3（ON996340.1），其查询覆盖率为11%，同源性为78.98%。这表明其与已知噬菌体的基因组相似性约为50%，低于ICTV分类中通常用于定义属的70%阈值（Turner et al., 2023）。鉴于这种遗传距离和ICTV分类标准，我们提出 ΦXhv-1 定义了类 *Caudoviricetes* 中的一个新属，暂定名为 *Xanthorvitianvirus xhv1*。

进一步研究发现，ΦXhv-1 对 *X. hortorum* pv. *vitians* 的宿主范围较窄，仅能感染其中5个菌株（38%）。其中，LM16734、CFBP8643、LM16797 和 LM16736 四个菌株对 ΦXhv-1 高度敏感（EOP ≥ 0.9），而 CFBP7999 则表现出中等敏感性（EOP = 3.3 × 10??）。其余菌株则表现出抗性（EOP < 10??）（图2A）。这些结果在液体培养实验中得到了验证，敏感菌株在感染后没有观察到细菌生长。为了探究 ΦXhv-1 的宿主范围是否与细菌的系统发育有关，我们进行了系统发育信号分析。分析结果显示，没有显著的系统发育信号（δ = 0.46，p值=0.27），表明噬菌体的宿主范围与测试菌株的总体基因组相关性无关。在13个 *X. hortorum* pv. *vitians* 菌株的基因组中，我们总共鉴定了37种不同的抗噬菌体防御系统，平均每个菌株有13个系统。其中，CFBP498 拥有最多的防御系统（n = 19），而 CFBP8686 则携带最少的系统（n = 9）。这些系统被分为功能类别：17个为中止感染或核酸酶相关，9个为限制修饰（RM）相关，2个为毒素-抗毒素系统，9个则为未知功能类别。为了统计评估这些防御系统与 ΦXhv-1 易感性之间的潜在相关性，我们进行了逻辑回归分析。分析结果显示，单个抗噬菌体防御系统与对 ΦXhv-1 的抗性之间没有显著相关性（图2A）。在体外裂解实验中，我们发现 ΦXhv-1 的裂解过程与 MOI（感染复数）有关。在 MOI 为1时，细菌群体在2小时内完全裂解，而自发的抗性突变株在21小时后出现（图2B）。为了更好地表征 ΦXhv-1 在其生产菌株上的裂解活性，我们确定了其感染周期的关键参数。吸附速率常数估计为1.2 × 10?? mL·细胞?1·分钟?1，超过90%的噬菌体颗粒在前20分钟内吸附（图1B）。潜伏期约为20分钟，随后是60分钟的上升期，导致总裂解周期为115分钟。每个被感染的细胞平均释放23个新的病毒颗粒（图1C）。

通过 Tn-seq 分析，我们确定了36个对 ΦXhv-1 感染至关重要的基因。这些基因主要与膜生物合成相关，特别是 LPS 和多糖的生物合成。其中，19个基因形成了一个连续的26 kb区域，已被鉴定为 *X. hortorum* pv. *vitians* 中的 LPS 生物合成簇（Morinière et al., 2022）。这一簇包括五个功能区域：*cps*（或 *xan*）、*rml*、LPS、LPS2 和 LPS3。这些区域参与了核苷酸糖前体（如鼠李糖）的合成，以及鼠李糖基 O 抗原（OAg）主干和其侧链修饰的生物合成（Vorh?lter et al., 2001; Molinaro et al., 2002）。这些基因的功能从 *X. campestris* pv. *campestris* 的研究中得到了进一步理解，表明它们在 LPS 和黄单胞菌（xanthan）生物合成所需的核苷酸糖代谢途径中起关键作用（Steffens et al., 2016）。例如，*cpsG* 在该通路中起上游作用，参与 GDP-D-甘露糖、GDP-D-鼠李糖和 UDP-D-葡萄糖的合成，这些是 LPS 核心和 OAg 的关键成分（Vorh?lter et al., 2001; K?plin et al., 1992）。其突变可能导致 LPS 核心和 OAg 的丧失。此外，LPS1 区域中的基因指导鼠李糖基 OAg 单元的组装，*wxcA* 编码的糖基转移酶的失活会导致 OAg 的丧失，而不会影响其他 LPS 成分（Vorh?lter et al., 2001）。与这些数据一致，*X. hortorum* pv. *vitians* 中的 *wxcA* 突变导致较小、不光滑且较少粘液的菌落，符合粗糙 LPS 的表型。在 LPS3 区域中，我们发现了最高选择值的基因，其突变赋予了对 ΦXhv-1 的完全抗性，同时不影响体外生长。该区域预测编码参与 N-乙酰基-fucose（Fuc3Nac）残基合成和转移的酶，这些残基构成了 OAg 的侧支。在 *X. campestris* pv. *campestris* 中，*wxcK* 突变会导致鼠李糖主干的延长和侧链的丧失（Steffens et al., 2016）。进一步的生化分析将有助于确认在 *X. hortorum* pv. *vitians* 中是否也发生类似的结构变化。

我们发现，对 ΦXhv-1 抗性的突变会导致细菌在生菜中的致病性降低，这种抗性与致病性之间的权衡在多个突变株中被观察到。这些突变株在感染后表现出症状发生延迟和疾病严重性显著降低，与野生型菌株相比，20天后症状发生量减少了约50%（图4A和B）。为了探索这种致病性降低的可能原因，我们对菌株在叶组织中的繁殖进行了量化。所有菌株在10天后达到相似的菌落数（~10? CFU/cm2），只有 ΔLPS2 和 *wxcO*? 突变株表现出轻微的减少，这由 Wilcoxon 测试和 Bonferroni 校正后确认（图4D）。尽管菌落数相似，但被突变株感染的叶组织始终表现出较低的症状发生（图4C）。由于细菌的运动能力对于植物表面定殖和进入至关重要，我们接下来评估了突变株的运动能力。ΔLPS2 突变株和 *wxcA*? 突变株的扩散运动能力显著降低，分别比野生型减少了91%和61%（图5）。而运动能力的减少也与致病性下降相关，如 *cpsG*?、*wxcA*? 和 ΔLPS2 突变株的菌落直径分别减少了48%、52%和61%（图5）。相比之下，LPS3 区域的转座子突变株表现出显著增强的扩散运动能力，*wxcK*? 和 *wxcO*? 突变株的扩散运动能力分别提高了39%和33%，并且 *wxcO*? 突变株的运动能力也提高了63%。这种运动能力的变化可能与噬菌体抗性突变对细菌适应性和致病性的影响有关。

这一抗性与致病性之间的权衡现象在其他病原系统中也有所体现，包括植物病原细菌和人类病原体（Bartnik et al., 2022; Holtappels et al., 2020; Zhang et al., 2022; Brockhurst et al., 2021; Meaden et al., 2015）。大多数研究使用实验室诱导的突变来观察这种现象，例如在富营养的体外条件下，从 *Dickeya solani* 中分离出的对 φD5 噬菌体抗性的突变株，其携带 *hlyD* 和 *tuf* 基因突变，表现出在植株中适应性和致病性降低（Sokolova et al., 2023）。然而，在自然环境中研究植物病原细菌对噬菌体抗性的研究仍然较少，且其结果与体外研究存在差异。例如，一项关于 *Pseudomonas syringae* pv. *tomato* 与两种裂解性噬菌体共同进化的研究显示，在自然环境中（如番茄叶的细胞间隙）未观察到噬菌体抗性突变株的出现，而在体外条件下，抗性突变迅速发展并达到高频率（Hernandez and Koskella, 2019）。相反，另一项研究报告称在植株中分离出一种 *Pseudomonas syringae* pv. *actinidiae* 对噬菌体 ΦPsa374 抗性的突变株，该突变株携带一个 LPS 糖基转移酶的突变，但保持了完整的致病性（Warring et al., 2022）。这些相互矛盾的结果表明，需要进一步研究噬菌体与细菌的相互作用，特别是噬菌体靶向受体及其在致病性中的作用。此外，这些发现也强调了设计针对多种细菌受体的噬菌体混合物对于开发可持续且有效的噬菌体生物控制策略的重要性（Holtappels et al., 2021）。

本研究的结论表明，可持续的噬菌体生物控制策略依赖于对细菌抗性机制的精确表征和深入理解。我们表征了新分离的噬菌体 ΦXhv-1，该噬菌体属于一个新的类 *Caudoviricetes* 属，突显了其在生物控制中的关键特征。尽管其对 *X. hortorum* pv. *vitians* 的多样性菌株有效，但为了覆盖该病原体的全部多样性，需要将 ΦXhv-1 与其他已被充分研究的噬菌体结合。我们的研究利用 Tn-seq 和靶向诱变技术，证明了 LPS 在 ΦXhv-1 吸附中的关键作用。阐明其他活跃噬菌体与细菌之间的相互作用将有助于通过选择具有多样宿主分子靶点的噬菌体，进行理性设计以实现持久的治疗效果。此外，观察到的 LPS 突变导致的细菌致病性显著降低表明，抗性突变可能带来显著的适应性代价。这意味着即使在田间条件下出现抗性突变，这些突变体的生态成功和致病潜力也可能受到限制。因此，噬菌体生物控制可能仍然有效，要么通过消灭易感菌株，要么通过选择致病性较低的突变株。本研究显著推动了针对 *X. hortorum* pv. *vitians* 的噬菌体生物控制策略的发展，并加深了我们对 *Xanthomonas* 噬菌体受体的理解。

此外，研究团队成员在本研究中发挥了重要作用。Anaelle Baud 负责概念化、实验设计、原始草稿撰写、方法学、可视化、形式分析和数据管理。Lucas Morinière 参与了形式分析、软件开发和审阅编辑。Imane El Idrissi 参与了审阅编辑、实验设计和形式分析。Fernando Clavijo-Coppens 负责实验设计、审阅编辑和可视化。Elise Lacroix 负责实验设计、审阅编辑和方法学。Nicolas Taveau 参与了实验设计、可视化和审阅编辑。Denis Costechareyre 负责审阅编辑、资金获取、验证、项目管理、资源获取。Franck Bertolla 参与了审阅编辑、项目管理、资金获取、概念化、监督、资源获取、验证和方法学。这些贡献确保了本研究的全面性和科学性。

本研究也得到了一些机构和人员的感谢和支持。作者感谢 Julie BALTENNECK 和 Erwan GUEGUEN 在 Tn-seq 实验中的帮助和专业知识。此外，感谢 FNX 和 Phages.fr 网络在科学会议期间的深入讨论。我们还感谢 I2BC 高通量测序设施提供的测序和生物信息学支持。Anaelle Baud 的博士研究得到了法国教育部、研究与创新部的资助。本研究是法国农业与食品研究机构（FranceAgriMer）的 PHAG2-S 项目的一部分。这些支持和合作对于本研究的顺利进行至关重要。

总之，本研究揭示了噬菌体 ΦXhv-1 与 *X. hortorum* pv. *vitians* 之间的相互作用机制，并强调了 LPS 在噬菌体吸附和细菌致病性中的关键作用。这些发现为未来开发基于噬菌体的可持续生物控制策略提供了重要的科学依据，并进一步加深了我们对 *Xanthomonas* 噬菌体受体的理解。通过深入研究噬菌体与宿主细菌的相互作用，可以更好地设计针对不同宿主分子靶点的噬菌体，从而实现更有效的病害控制。