基于计算机模拟的人类β-葡萄糖醛酸酶结构分析在抗体-药物偶联物优化中的应用

《Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics》：In Silico Structural Analysis of Human β-Glucuronidase for Antibody–Drug Conjugates Optimization

HGUSB酶的结构稳定性和β-葡萄糖尿苷连接子的最佳适配性通过分子对接与动力学模拟研究，揭示了单聚体模型在解析大分子复合物中的有效性，并确定含 maleimide基团的连接子（Linker3）结合最稳定，为靶向癌症治疗ADC开发提供结构依据。

　　人类β-葡萄糖醛酸酶（HGUSB）是一种关键的溶酶体糖苷水解酶，它在糖胺聚糖（GAGs）的降解过程中发挥着重要作用。GAGs是一类线性多糖，由重复的二糖单元组成，其中包含氨基糖（如N-乙酰葡萄糖胺或N-乙酰半乳糖胺）和尿苷酸（如葡萄糖醛酸或艾杜糖醛酸）。HGUSB主要负责在溶酶体中催化这些GAGs的分解，其活性与细胞增殖和炎症反应密切相关。这种酶的结构由四个相同的亚基组成，每个亚基包含651个氨基酸残基，总共有2604个残基。HGUSB的活性位点位于其C末端结构域，其中包括几个关键的氨基酸残基，如Glu451（质子供体）、Glu540（碳正离子稳定剂）、Asp207（同样具有稳定碳正离子的作用）以及Tyr504（催化作用尚不明确）。

HGUSB在催化反应中通过SN2反应机制和“构型保留”机制将含有葡萄糖醛酸的底物水解为对应的脱糖基产物和游离的β-D-葡萄糖醛酸。这一过程涉及底物与活性位点的结合，随后由水分子参与的催化反应，最终形成一个酶-糖基的共价中间体，并通过水的亲核攻击完成水解反应。该酶在肿瘤细胞中表现出高活性，因此成为抗体药物偶联物（ADCs）开发的重要靶点，ADCs通过HGUSB对β-葡萄糖醛酸连接子的水解作用，能够实现对恶性细胞的靶向释放，从而提高治疗效果并减少对正常组织的毒性。

为了深入理解HGUSB与不同连接子的相互作用机制，本研究采用分子对接和分子动力学（MD）模拟方法，分析HGUSB与底物、抑制剂和β-葡萄糖醛酸连接子的结合情况。研究首先对几种商业底物和一个已知的抑制剂进行了分析，以确定HGUSB最稳定的结合构型。接着，基于这些已知配体的结合机制，评估了HGUSB与不同连接子的相互作用，从而揭示了酶与ADCs之间的识别机制。研究结果表明，含有马来酰亚胺基团的亲水性β-葡萄糖醛酸连接子表现出最高的结合稳定性，因此被确定为本研究中分析的最佳连接子。

在材料和方法部分，HGUSB的晶体结构从蛋白质数据库（PDB）中获取，使用PDB ID 3HN3作为初始结构。该结构随后通过MOE软件进行了优化，包括去除辅因子、异质原子、水分子和N-连接糖链。为了更准确地模拟HGUSB与抑制剂的结合，使用了PDB ID 6LEG中E. coli β-葡萄糖醛酸酶与抑制剂尿酮异果糖（UIFG）的结合结构，其中UIFG与酶的结合比为1:4。通过序列相似性分析、对齐和叠加，确认了UIFG在HGUSB结合位点的正确位置，并进一步生成了其他三种不同的结合比例（1:1、1:2和1:4）的复合物。

分子对接分析采用了MOE 2022.02的“Dock”工具，对五种商业底物和八种β-葡萄糖醛酸连接子进行了计算。此外，还对来自默克公司的马来酰亚胺基团亲水性β-葡萄糖醛酸连接子进行了分析。这些连接子的化学结构在附图S1和S2中有所描述。对接过程中，所有化合物均经过MOE的“Wash”工具处理，包括去除多余的盐、固定质子化状态、再生三维坐标和进行能量最小化。随后，使用“构象搜索”工具评估了每种配体的最稳定构型，并通过PLIF工具筛选出与活性位点残基（如Asp207、Glu451、Tyr504和Glu540）发生相互作用的结合位点。

MD模拟采用不同的方法对HGUSB与这些配体的复合物进行了深入研究。通过使用MOE软件对系统进行预处理，包括溶剂化处理和能量最小化，确保模拟的准确性。在模拟过程中，使用了AMBER20作为模拟软件，并应用了PME方法处理长程静电相互作用，同时将非键相互作用截断在10 ?处。模拟的温度保持在300 K，压力恒定在100 kPa，确保了系统的热力学稳定性。通过NPT和NVT系综进行预平衡处理后，MD模拟正式运行，持续时间为500 ns，时间步长为2 fs。

在结果与讨论部分，分子对接结果显示连接子与HGUSB的结合亲和力高于底物。通过PLIF工具筛选后，得到了479种可能的结合构型。进一步的MD模拟分析表明，HGUSB与抑制剂的结合更为稳定，其Cα原子的RMSD值在1.0至2.6 ?之间，而与底物的结合则表现出更大的波动性，RMSD值可达4.4 ?。这说明抑制剂能够更有效地稳定HGUSB的结构，而底物则在反应完成后迅速脱离结合位点。

在对四聚体HGUSB的不同结合状态进行分析时，发现当抑制剂结合到相邻的亚基时，其结构影响较为局部化，不会显著改变整个四聚体的构象。相反，当抑制剂结合到对角线上的亚基时，其对结构的影响更为明显，部分亚基的RMSD值波动较大，表明结构稳定性下降。通过DCC分析，进一步验证了这种局部影响的结论，显示抑制剂在不同结合位置对HGUSB的结构动态具有不同的调控作用。

对于连接子的稳定性分析，采用单体HGUSB模型进行模拟，该模型被证明能够有效捕捉到连接子与酶的相互作用。模拟结果表明，连接子1和连接子2在某些情况下表现出不稳定的结合，其RMSF值在模拟过程中达到了10 ?左右，表明存在脱离结合位点的风险。相比之下，连接子3表现出更高的稳定性，其RMSF值波动较小，且在模拟过程中能够保持持久的结合状态。此外，H-键分析进一步支持了这一结论，连接子3能够与多个关键的催化位点残基形成稳定的相互作用，而连接子1和连接子2则主要与Asp207发生相互作用，导致结合不稳定。

本研究的结果不仅揭示了HGUSB与连接子的相互作用机制，还为设计和优化基于β-葡萄糖醛酸连接子的ADCs提供了重要的结构基础。通过分析不同连接子的结合稳定性，研究团队能够确定最适合作为ADCs连接子的候选分子，从而为开发更具靶向性和有效性的抗癌药物提供了新的思路。此外，研究还强调了单体模型在模拟HGUSB与连接子相互作用中的高效性，避免了对整个四聚体进行模拟的复杂性和计算成本，同时保证了结构动态的准确性。这些发现为未来基于HGUSB的靶向治疗策略提供了坚实的理论依据。