齿食道口线虫排泄分泌分子与细胞外囊泡的miRNA和RNAi相关蛋白特征及其在宿主互作中的意义

《International Journal for Parasitology》：Analysis of Oesophagostomum dentatum excretory-secretory molecules and extracellular vesicles uncovers a repertoire of miRNAs shared with A. suum and T. suis and ES containing Paz and Piwi domain proteins implicated in RNAi signaling

本研究针对猪结节虫齿食道口线虫(Oesophagostomum dentatum)为何能逃逸宿主免疫建立慢性感染这一关键问题，系统解析了其排泄分泌产物(ES)及细胞外囊泡(EVs)中的蛋白质和miRNA组成。研究人员通过蛋白质组学和小RNA测序技术，首次鉴定了该寄生虫ES中的88个成熟miRNA，发现EVs中富含参与RNA干扰(RNAi)的Paz/Piwi结构域蛋白和RNA解旋酶，并鉴定出8个在猪蛔虫(Ascaris suum)和猪鞭虫(Trichuris suis)间高度保守的miRNA家族。该研究为阐明寄生虫免疫逃逸机制提供了新视角，对开发新型抗寄生虫策略具有重要意义。

　　

在养猪业中，土壤传播的蠕虫感染是一个长期存在的健康问题，其中齿食道口线虫(Oesophagostomum dentatum)作为一种结节虫，能够在家猪体内建立慢性感染，严重影响动物福利和生产效率。与猪蛔虫(Ascaris suum)和猪鞭虫(Trichuris suis)不同，齿食道口线虫能够诱导异常的免疫反应模式——它首先引发促炎性的1型辅助性T细胞(Th1)样反应，随后才产生延迟的非保护性Th2反应，这种独特的免疫调节能力使其能够长期寄生而宿主几乎不产生获得性免疫力。然而，这种差异性免疫调节背后的分子机制至今尚未明确。

肠道寄生虫主要通过排泄分泌分子与宿主相互作用，而细胞外囊泡作为这些分子中的重要载体，在宿主-寄生虫互作中扮演着关键角色。为了深入探究齿食道口线虫的免疫调节机制，由Maibritt Mardahl领衔的研究团队在《International Journal for Parasitology》上发表了他们的最新研究成果，系统分析了齿食道口线虫感染性L3幼虫和成虫阶段的排泄分泌分子及细胞外囊泡组成，特别关注了其中的蛋白质和miRNA内容。

研究人员采用了一系列先进的技术方法开展本研究。他们从感染齿食道口线虫的家猪体内收集寄生虫材料，通过差速超速离心和尺寸排阻色谱分离细胞外囊泡。利用冷冻电镜验证囊泡形态，纳米颗粒跟踪分析测定囊泡大小和浓度。蛋白质组分析采用液相色谱-串联质谱技术，对成虫排泄分泌产物、细胞外囊泡和囊泡 depleted上清进行蛋白质鉴定。小RNA测序则用于分析L3幼虫囊泡、成虫囊泡和囊泡 depleted上清中的miRNA组成，通过MirMachine和MirMiner工具进行miRNA注释和定量分析。

3.1. 齿食道口线虫成虫细胞外囊泡的冷冻电镜分析

通过尺寸排阻色谱分离成虫排泄分泌产物，研究人员成功富集了齿食道口线虫的细胞外囊泡。纳米颗粒跟踪分析显示囊泡主要分布在100纳米左右，蛋白定量和银染证实了囊泡富集效果。冷冻电镜直观展示了具有典型双层膜结构的真实囊泡存在，为后续研究奠定了坚实基础。

3.2. 蛋白质组学分析

蛋白质组学分析共鉴定出592个蛋白质，其中排泄分泌产物中包含582个蛋白质，细胞外囊泡中有189个，囊泡 depleted上清中含有57个。研究发现细胞外囊泡中富含SCP样蛋白、转甲状腺素蛋白样蛋白、肽酶、水解酶等典型排泄分泌蛋白。特别值得注意的是，细胞外囊泡中含有9个特有蛋白质，均具有酶功能，包括蛋白酶、肽酶和一个RNA解旋酶。通路富集分析显示，细胞外囊泡蛋白质显著富集于营养代谢和蛋白酶体通路。尤为引人关注的是，研究在成虫排泄分泌产物中发现了与RNA干扰通路相关的Paz结构域蛋白和Piwi结构域蛋白，这些蛋白与Heligmosomoides bakeri细胞外囊泡中发现的exWAGO蛋白具有序列相似性。

3.3. miRNA谱分析

研究人员首次注释了齿食道口线虫排泄分泌产物的miRNA组成，共鉴定出44个前体miRNA和88个成熟/star miRNA。在L3幼虫囊泡、成虫囊泡和囊泡 depleted上清中分别检测到22、44和48个miRNA。差异表达分析发现，成虫囊泡与囊泡 depleted上清之间有11个miRNA存在显著丰度差异，其中4个在囊泡中富集，7个在上清中富集。特别值得注意的是，Ode-Mir-216-P1-5p在成虫囊泡中显著富集，表明寄生虫可能对miRNA进入囊泡具有选择性排序机制。

3.4. 齿食道口线虫、猪鞭虫和猪蛔虫成虫细胞外囊泡的miRNA家族谱比较

跨物种比较研究揭示了三种寄生虫细胞外囊泡中miRNA组成的异同。研究发现，齿食道口线虫、猪鞭虫和猪蛔虫共享8个miRNA家族，包括L