大黄素通过直接靶向犬新孢子虫抑制其侵袭与增殖的机制研究

《International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance》：Evaluation of the inhibitory effects of emodin on Neospora caninum invasion and proliferation in vitro

本研究针对新孢子虫病缺乏有效防治药物的现状，系统评估了大黄素（emodin）在Vero细胞、MDBK细胞和巨噬细胞中对犬新孢子虫（Neospora caninum）侵袭和增殖的抑制作用。研究发现大黄素能直接作用于虫体，显著降低其侵袭能力（55%-63%）和增殖能力（62%-88%），且与硝唑尼特（niclosamide）联用呈现协同效应。机制研究表明，大黄素虽可激活MLKL介导的坏死性凋亡（necroptosis），但其抗虫作用主要依赖直接靶向寄生虫的机制。该研究为开发新型抗新孢子虫病药物提供了候选化合物和理论依据。

　　

在全球畜牧业中，新孢子虫病（neosporosis）犹如一个隐形的"流产大师"，每年导致超过24亿美元的经济损失，受影响牛群的流产率高达47%。这种由犬新孢子虫（Neospora caninum）引起的原虫性疾病，至今缺乏有效的疫苗或治疗药物。曾经上市的商业化灭活疫苗Bovilis? Neoguard因保护效果不佳且可能增加早期胚胎死亡风险而被撤市。面对这一严峻挑战，科学家们将目光投向了天然产物中寻找解决方案。

近日发表于《International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance》的研究中，吉林大学的研究团队对传统中药中常见的蒽醌衍生物——大黄素（emodin）展开了系统研究。这种从大黄、虎杖等药用植物中提取的天然化合物，此前已被发现具有抗利什曼原虫、克氏锥虫、弓形虫等多种寄生虫的活性，但其对犬新孢子虫的作用尚不明确。

研究人员采用了一系列关键技术方法开展此项研究。他们通过CCK-8法测定药物安全浓度，使用qPCR和吉姆萨染色评估抗虫效果，并利用Western blot检测坏死性凋亡关键蛋白pMLKL的表达。实验涉及Vero细胞、MDBK细胞以及从野生型（WT）和Mlkl^-/-基因敲除小鼠分离的腹腔巨噬细胞等多种细胞模型，全面考察了大黄素在不同宿主细胞中的抗虫效果。

大黄素抑制犬新孢子虫在Vero细胞中的侵袭和增殖

研究发现，大黄素在Vero细胞中表现出低毒性，CC₅₀值为17.49 μM。在安全浓度范围内（2-6 μM），大黄素能剂量依赖性地抑制虫体侵袭和增殖，4 μM和6 μM浓度分别使虫体侵袭降低40%和57%，增殖降低47%和62%。选择指数（SI）显示大黄素在Vero细胞中具有良好安全性。

大黄素控制Vero细胞PVs内速殖子数量

吉姆萨染色结果显示，大黄素处理显著降低了感染率，并减少了每个寄生泡（PV）内的速殖子数量。在侵袭模型中，大黄素处理组的PVs主要包含2或4个速殖子，而对照组则以≥8个速殖子的PVs为主。

大黄素抑制犬新孢子虫在MDBK细胞中的侵袭和增殖

在牛肾细胞MDBK中，大黄素显示出更高的安全性（CC₅₀=29.25 μM）。4-10 μM大黄素显著抑制虫体侵袭（52%-73%）和增殖（48%-71%），SI值达到5.97-6.28，表明其在牛源细胞中具有更好的治疗窗口。

大黄素抑制犬新孢子虫在巨噬细胞中的侵袭和增殖

在免疫细胞模型中，4-12 μM大黄素使虫体侵袭降低49%-71%，增殖降低28%-63%。值得注意的是，大黄素对虫体侵袭的抑制效果甚至优于阳性对照药妥曲珠利（toltrazuril）。

大黄素直接抑制速殖子的侵袭和增殖能力

通过直接预处理速殖子，研究发现2-6 μM大黄素使虫体侵袭能力降低55%-63%，增殖能力降低62%-88%，表明大黄素具有直接抗虫作用，而非仅通过宿主细胞发挥作用。

大黄素与硝唑尼特的联合治疗增强抗犬新孢子虫效果

联合用药实验显示，大黄素与硝唑尼特具有协同效应，协同得分达17.467。特别是4 μM大黄素与0.2 μM硝唑尼特组合对虫体增殖的抑制效果最佳，为开发联合治疗方案提供了依据。

大黄素通过坏死性凋亡非依赖途径抑制犬新孢子虫在巨噬细胞中的侵袭和增殖

机制研究发现，虽然大黄素处理增加了LHD释放和pMLKL蛋白表达，表明其可激活坏死性凋亡通路，但在Mlkl^-/-巨噬细胞中，大黄素的抗虫效果并未显著改变，说明其作用不依赖MLKL介导的坏死性凋亡。

研究结论与讨论部分指出，大黄素通过直接靶向犬新孢子虫发挥抗虫作用，这一机制不同于传统的线粒体损伤途径。虽然大黄素可激活坏死性凋亡，但这并非其抗虫的主要机制。研究还发现，大黄素在牛源MDBK细胞中的安全性更高，提示其在反刍动物中可能具有更好的应用前景。

该研究的创新之处在于首次系统揭示了大黄素抗犬新孢子虫的活性，并阐明了其直接靶向寄生虫的作用特点。联合用药方案的探索为克服单药治疗可能导致的耐药性问题提供了新思路。尽管研究缺乏体内实验验证，但其体外结果为大黄素作为抗新孢子虫病候选药物的开发奠定了坚实基础。未来研究可进一步探索大黄素与疫苗联用的策略，以及其直接抗虫的具体分子靶点，为新孢子虫病的防治提供更多有效手段。