靶向上皮膜蛋白2(EMP2)的抗体药物偶联物：肺癌精准治疗新策略

《Cell Death & Disease》：Development of antibody drug conjugates targeting epithelial membrane protein 2-highly expressed lung cancer

本刊推荐：针对肺癌治疗响应率低、预后差的临床挑战，研究人员开展了靶向上皮膜蛋白2(EMP2)的抗体药物偶联物(ADC)开发研究。通过蛋白质组表位标签抗体库(PETAL)筛选获得特异性靶向EMP2的FK002抗体，构建FK002-exatecan ADC。研究证实该ADC能有效内化至肿瘤细胞，诱导细胞周期阻滞和凋亡，在多种肺癌模型（包括PDX和PTC模型）中展现显著抗肿瘤活性。该研究为EMP2高表达肺癌（尤其肺鳞癌）提供了新的精准治疗策略。

　　

肺癌作为全球范围内最具破坏性的癌症类型之一，其治疗一直面临巨大挑战。尽管分子靶向治疗和免疫检查点抑制剂的出现显著改善了非小细胞肺癌(NSCLC)患者的预后，但总体5年生存率仍仅为16%左右。更令人担忧的是，免疫治疗的有效率普遍偏低（20-30%），且肺鳞状细胞癌(LSCC)患者尚未从靶向治疗中显著获益。这种治疗困境促使科学家不断探索新的治疗策略，而抗体药物偶联物(ADC)技术的出现为肺癌精准治疗带来了新的希望。

ADC是一类由三个核心组成部分构成的精准抗癌药物：特异性识别肿瘤相关抗原的抗体、化学连接子和细胞毒性载荷。这种"魔法子弹"式的设计理念能够显著提高化疗药物在肿瘤细胞内的积累，同时降低全身给药的非特异性细胞毒性效应。目前FDA已批准16种ADC用于肿瘤治疗，但在肺癌领域仍缺乏有效的ADC靶点。

上皮膜蛋白2(EMP2)作为四跨膜蛋白超家族成员，近年来在多种人类癌症中被证明是具有潜力的治疗靶点。研究表明EMP2在63%的浸润性乳腺癌和73%的三阴性乳腺癌中高表达，在子宫内膜癌恶性转化过程中表达水平显著升高。值得注意的是，EMP2在癌症发病机制中表现出器官特异性功能：在激素相关癌症中作为癌基因，而在尿路上皮癌中则发挥肿瘤抑制因子作用。这种独特的表达特征使EMP2成为ADC开发的理想靶点。

在这项发表于《Cell Death and Disease》的研究中，研究人员通过组织微阵列抗体库筛选技术，成功开发出靶向EMP2的ADC药物FK002-exatecan，为EMP2高表达肺癌患者提供了新的治疗选择。

关键技术方法

研究采用蛋白质组表位标签抗体库(PETAL)包含62,208个单克隆抗体，针对15,199个肽段进行肺癌细胞表面结合抗体筛选。通过流式细胞术和免疫组织化学(IHC)双重筛选策略，从临床肺癌样本（包括肺腺癌30例、肺鳞癌25例、小细胞肺癌25例及配对癌旁组织）中鉴定出EMP2特异性抗体FK002。利用表面等离子共振(SPR)技术测定抗体亲和力，通过高效液相色谱(HPLC)分析药物抗体偶联比(DAR)。抗肿瘤效果评估采用患者来源异种移植(PDX)模型、患者来源肿瘤样细胞簇(PTC)模型以及传统异种移植模型，结合隧道染色(TUNEL)、免疫荧光等技术验证作用机制。

研究结果

构建肺癌细胞表面结合单克隆抗体图谱

研究人员利用PETAL技术平台，通过两阶段筛选策略构建肺癌细胞表面抗体-靶点图谱。第一阶段使用混合肺癌细胞系（包括肺鳞癌细胞系NCI-H226、NCI-H520、SK-MES-1、NCI-H2170和小细胞肺癌细胞系NCI-H69、NCI-H526）进行流式细胞术筛选，以平均荧光强度(MFI)>1为阈值，初步鉴定出940个细胞结合单克隆抗体。第二阶段采用临床肺癌样本进行验证，最终筛选出12个在肺癌组织中表达升高且特异性良好的抗体，其中FK002抗体在人类肺癌样本中的阳性率最高（31%），尤其在肺鳞癌中表达显著。

FK002抗体的生成和靶点验证

通过质谱分析确定FK002抗体的抗原序列为KFYPVTREGS，与人EMP2蛋白匹配。内源性共免疫沉淀实验显示FK002抗体特异性结合目标蛋白条带。流式细胞术验证表明FK002的特异性优于已知的EMP2抗体KS49。免疫荧光和免疫印迹分析进一步证实FK002抗体特异性靶向人EMP2。SPR实时分析显示FK002与固定化EMP2蛋白的结合解离动力学，测得KD值为4.03×10^-8 M，表明抗体与靶抗原具有中等亲和力。

EMP2靶向抗体药物偶联物的表征

FK002-exatecan的结构设计中，exatecan通过T1000连接子与FK002偶联。T1000是一种新型连接子载荷技术，能够克服exatecan强疏水性导致的抗体直接偶联困难，赋予ADC更强的旁观者效应和肿瘤浸润能力。SEC-HPLC分析显示FK002-exatecan的纯度为98.99%，HIC-HPLC结果显示一个主峰，代表8个T1000-Exatecan的偶联，药物抗体偶联比(DAR)为8:1。体外血浆稳定性实验表明，FK002-exatecan在人血浆中孵育20天后，仅有不到2%的exatecan从偶联物中解离。

FK002-exatecan诱导EMP2内化

为研究ADC的作用机制，研究人员构建了hEMP2-GFP融合过表达的NCI-A549、NCI-H520和LLC细胞系。免疫荧光分析显示，FK002-exatecan刺激后，EMP2与溶酶体相关标志物(lysotracker)共定位，膜表面EMP2蛋白显著减少。定量分析证实FK002-exatecan诱导ADC-EMP2复合物内化。流式细胞术进一步验证，FK002-exatecan刺激后细胞表面EMP2残留量不足35%，表明该ADC具有良好的内化能力。

FK002-exatecan体外诱导细胞周期阻滞和凋亡

通过免疫印迹筛选发现PC9、NCI-H226和SK-MES-1等肺癌细胞系高表达EMP2。细胞活力实验表明，FK002-exatecan能够以剂量依赖方式特异性杀伤EMP2高表达肿瘤细胞。Annexin V/PI凋亡检测显示，与阴性对照相比，10 nM和100 nM FK002-exatecan处理24小时可诱导EMP2高表达肺癌细胞凋亡。流式细胞术分析证实FK002-exatecan诱导肿瘤细胞在DNA合成(S)期发生细胞周期阻滞。这些结果综合表明FK002-exatecan通过靶向EMP2显著诱导细胞周期阻滞并增加EMP2过表达肿瘤细胞的凋亡。

FK002-exatecan通过靶向EMP2发挥抗肿瘤活性

研究人员在系列肺癌模型中评估FK002-exatecan的抗肿瘤活性。患者来源肿瘤样细胞簇(PTC)模型能够在获得恶性胸水后2周内完成药物疗效测试，16例肺癌患者来源的PTC中，8例为EMP2高表达，8例为低表达。在高EMP2表达组中，FK002-exatecan能有效抑制PTC肿瘤生长，且呈浓度依赖性，而在EMP2低表达或检测不到的组中无此效果。患者来源异种移植(PDX)模型实验显示，与IgG-exatecan对照组相比，FK002-exatecan治疗显著降低肿瘤生长，且小鼠体重无显著变化，表明ADC药物无明显副作用。隧道染色证实FK002-exatecan有效诱导EMP2高表达肺癌细胞凋亡。

异种移植模型实验进一步证实，FK002-exatecan对移植的H520-EMP2、NCI-H226、SK-MES-1和PC9细胞生长具有相似抑制作用，肿瘤重量较IgG-exatecan对照组显著降低。值得注意的是，即使在降低剂量(1 mg/kg)和给药频率(每三周一次)的情况下，FK002-exatecan仍表现出显著抗肿瘤功效，证实其靶向特异性和持续药理作用。隧道染色再