效应蛋白AGLIP1劫持过氧化物酶OsAPX8协调水稻免疫抑制与ROS驱动的细胞死亡以促进立枯丝核菌侵染的机制研究

《Journal of Advanced Research》：The effector AGLIP1 hijacks peroxidase OsAPX8 to coordinate rice immune suppression and ROS-Driven cell death for facilitating Rhizoctonia solani infection

本研究聚焦水稻纹枯病防治难题，揭示了立枯丝核菌效应蛋白AGLIP1通过双重机制介导病原体侵染的新范式。研究人员通过多组学技术发现AGLIP1直接靶向叶绿体抗坏血酸过氧化物酶OsAPX8，不仅抑制其H2O2清除活性，更将其重新定位至过氧化物酶体，导致活性氧（ROS）爆发性积累。该研究首次阐明病原体通过空间重编程宿主抗氧化防御系统的分子机制，为开发新型抗病育种策略提供了理论靶点。

　　

水稻作为全球主要粮食作物，其安全生产始终面临诸多病害威胁。其中由立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）引起的水稻纹枯病（Rice Sheath Blight, RSB）堪称水稻的"癌症"，每年造成全球高达50%的产量损失。这种坏死营养型病原真菌采用独特的"先抑制后杀戮"策略：在侵染初期分泌效应蛋白抑制宿主免疫反应，后期则诱导植物细胞死亡从而获取营养。然而，这种双功能效应蛋白如何精确调控免疫抑制与细胞死亡程序的分子开关，长期以来是植物病理学领域未解的谜题。

近期发表在《Journal of Advanced Research》的研究论文首次揭示了立枯丝核菌效应蛋白AGLIP1通过劫持水稻抗氧化防御系统的核心元件——抗坏血酸过氧化物酶OsAPX8，巧妙协调免疫抑制与活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）驱动细胞死亡的双重致病机制。这项研究不仅阐明了病原菌操纵宿主细胞程序的新颖策略，更为作物抗病育种提供了新的分子靶标。

研究人员采用转基因过表达株系、CRISPR-Cas9基因敲除、宿主诱导基因沉默（Host-Induced Gene Silencing, HIGS）技术、病原性测定、相互作用蛋白质组学、酶动力学测量和共聚焦成像等关键技术方法。实验材料包括水稻品种中花11（ZH11）野生型及转基因株系，立枯丝核菌强毒力（SYYZ81）和弱毒力（SDJN102）菌株，本氏烟（Nicotiana benthamiana）等模式植物。

异源表达AGLIP1引发ROS介导的细胞死亡和水稻发育缺陷

研究人员构建了AGLIP1过表达转基因水稻株系（AGLIP1-OE），发现其表现出多效性发育缺陷，包括愈伤组织坏死、渐进性叶片坏死和结实率降低。DAB（3,3′-二氨基联苯胺）组织化学染色显示坏死区域存在显著的H₂O₂积累。qRT-PCR分析表明细胞死亡抑制因子OsHLM1和OsMT2b的表达下调，这些发现表明AGLIP1可能通过促进ROS介导的细胞死亡作为毒力因子发挥作用。

AGLIP1是立枯丝核菌致病性不可或缺的因子

病原性测定显示，AGLIP1-OE株系对弱毒力立枯丝核菌分离株SDJN102表现出超敏感性，病斑面积显著增加，真菌生物量升高。相反，通过HIGS技术沉默AGLIP1基因的水稻株系对强毒力分离株SYYZ81表现出增强的抗性，病斑面积和真菌生物量显著降低。这些双向实验结果证实AGLIP1是立枯丝核菌的关键毒力因子。

通过整合免疫沉淀-质谱联用技术筛选与AGLIP1互作的水稻蛋白

相互作用蛋白质组学分析鉴定出134个AGLIP1特异性互作蛋白。基因本体（Gene Ontology, GO）分析显示这些蛋白显著富集于叶绿体和膜系统组分，功能注释提示与光呼吸、光合作用途径和氧化还原相关过程有关。其中，叶绿体靶向的ROS清除剂OsAPX8成为顶级候选靶标。

AGLIP1在体内和体外均与OsAPX8相互作用

通过分裂荧光素酶（Split-LUC）互补实验、双分子荧光互补（Bimolecular Fluorescence Complementation, BiFC）、共免疫沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）和体外pull-down实验，研究人员验证了AGLIP1与OsAPX8之间的物理相互作用。Bi实验揭示了这种相互作用的时空动态：在转染后10小时观察到双重的叶绿体-过氧化物酶体定位，而在16小时转变为特异性过氧化物酶体关联。

OsAPX8正向调控水稻对纹枯病的抗性

通过CRISPR/Cas9技术构建的osapx8功能缺失突变体表现出对纹枯病的抗性受损，病斑面积扩大，真菌生物量增加。相反，OsAPX8过表达不仅挽救了突变体表型，还提高了病原抗性和免疫反应。尽管APX已知调控叶绿体发育和光合效率，但osapx8突变体在标准生长条件下未表现出可见的发育异常，但组成型叶绿素含量降低。

AGLIP1在植物体内和体外抑制OsAPX8的过氧化物酶活性

酶活性分析表明，OsAPX8的关键催化残基（S243、H246、W278）对其过氧化物酶活性至关重要。在水稻原生质体中，AGLIP1与OsAPX8共表达完全消除了其过氧化物酶活性，而无毒力的AGLIP1变体（S174A、D230A）未能抑制酶功能。这种毒力依赖性抑制在无细胞酶测定中得到了进一步验证。

OsAPX8过表达拮抗AGLIP1触发的植物细胞死亡

在本氏烟叶片中，野生型OsAPX8显著减弱了AGLIP1触发的细胞死亡，而催化失活突变体（S243A、H246A、W278A）没有保护作用。非催化突变体（R219A、K264A）不损害AGLIP1毒力，证实了酶活性在抵消效应蛋白功能中的特异性。水稻原生质体中的荧光素酶细胞活力实验进一步验证了这种功能拮抗作用。

AGLIP1将OsAPX8从叶绿体重定向至过氧化物酶体

共聚焦显微镜分析显示，AGLIP1-GFP特异性积累在过氧化物酶体中，而OsAPX8-mCherry定位于叶绿体。AGLIP1-GFP与OsAPX8-mCherry共表达触发了OsAPX8从叶绿体到过氧化物酶体的重新定位。无毒力AGLIP1变体（AGLIP1^NSP、AGLIP1^S174A或AGLIP1^D230A）未能改变OsAPX8的叶绿体定位，证实效应蛋白介导的重新定位需要完整的致病性决定簇。

OsAPX8过氧化物酶体错误定位和失活消除纹枯病抗性

鞘接种实验表明，表达催化突变体（OsAPX8^S243A、OsAPX8^H246A）或过氧化物酶体靶向变体（OsAPX8^NSP/PTS1）的osapx8株系表现出显著增加的病斑高度和真菌生物量。几丁质诱导的基础防御基因OsPR10a和OsPAL1的表达在表达催化突变体或过氧化物酶体靶向变体的株系中被显著抑制。这些结果证明酶活性和叶绿体定位对于OsAPX8介导的防御信号激活和纹枯病抗性都是不可或缺的。

研究结论揭示了一个新颖的致病模型：在未受挑战的植物中，OsAPX8通过其过氧化物酶活性在核合成和叶绿体运输后维持叶绿体氧化还原平衡。立枯丝核菌侵染时，AGLIP1协调双重攻击：初始抑制防御基因表达以削弱宿主免疫力，然后直接结合OsAPX8阻断其ROS清除能力。关键的是，AGLIP1将OsAPX8从叶绿体重定向至过氧化物酶体，其功能失活驱动致病性ROS积累和细胞死亡——这一生理转变标志着病原体从活体营养定植向坏死营养破坏的过渡。

这项研究突破了病原体对抗防御机制的传统范式，证明了坏死营养型病原体如立枯丝核菌通过效应蛋白靶向ROS清除系统来破坏植物免疫力。特别是立枯丝核菌效应蛋白AGLIP1利用其脂肪酶活性将抗氧化酶OsAPX8从叶绿体重定向至过氧化物酶体，从而产生有利于病原体增殖的微环境。这一发现通过揭示涉及宿主防御组分空间操纵的毒力策略，扩展了我们对植物-病原体相互作用的理解，同时将OsAPX8-AGLIP1相互作用确定为新型疾病控制策略的潜在靶标。该研究为开发通过稳定OsAPX8功能或阻断AGLIP1相互作用来培育抗纹枯病水稻品种的创新策略提供了理论依据。