热链球菌来源的CpG-ODN通过激活caspase-8诱导小鼠脾细胞外源性凋亡及其应用前景

《Journal of Immunological Methods》：CpG-ODN from Streptococcus thermophilus as a tool for inducing extrinsic apoptosis via caspase-8 activation in mouse splenocytes

本研究首次报道了从益生菌热链球菌lacZ基因中鉴定的新型CpG-ODN（MsST）可有效激活Toll样受体9（TLR9），通过caspase-8介导的外源性凋亡途径诱导小鼠脾细胞程序性死亡。该发现为开发基于CpG-ODN的凋亡诱导工具提供了方法论基础，对肿瘤免疫治疗和自身免疫疾病干预具有重要启示意义。

　　

研究亮点

通过基因组DNA片段化实验证实，源自热链球菌lacZ基因的CpG-ODN（MsST）能诱导显著的中等程度核小体间DNA断裂。采用膜联蛋白V/7-氨基放线菌素D（annexin V/7-AAD）双染法的流式细胞术分析显示，MsST处理后的凋亡细胞群呈现时间依赖性增长。Western blot结果进一步验证了剪切型caspase-8表达上调，明确了外源性凋亡通路（extrinsic apoptosis pathway）的激活机制。

讨论

本研究建立了一种利用合成CpG-ODN（特别是热链球菌来源的MsST）诱导小鼠脾细胞凋亡的方法学体系。综合基因组DNA断裂分析、膜联蛋白V/7-AAD流式细胞术和caspase-8激活检测结果，证实MsST能稳定诱发细胞凋亡。与典型CpG-ODN及放线菌素D（actinomycin D）相比，MsST展现出独特的凋亡诱导特性，为基于TLR9信号通路的免疫调控研究提供了新视角。该技术平台有望推动CpG-ODN在癌症免疫治疗、自身免疫疾病和炎症性疾病治疗领域的应用开发。

实验动物

使用4周龄C57BL/6雄性小鼠（购自日本SLC株式会社），在信州大学动物设施的无特定病原体条件下适应饲养2周后，选取6-8周龄小鼠进行实验。

寡核苷酸

所有实验用磷硫酰骨架修饰的ODN均由Gene Design公司（日本大阪）和Integrated DNA Technologies公司（美国爱荷华州）提供，确保无内毒素且经过脱盐纯化。

伦理审批

所有实验程序遵循信州大学动物实验规程，经该校动物实验委员会批准（批文号300072），符合日本《动物爱护法》第105号法令及第6号通知要求。

作者贡献声明

Md. Rayhan Chowdhury：负责文稿撰写/修订、实验设计、数据整理与形式化分析；Takuma Okajima：参与数据 curation、方法学建立与资源整合；Aito Murakami：协助实验操作与数据分析；Ariful Islam：参与论文撰写与数据验证；Takeshi Shimosato：主导课题规划与学术监督。

利益冲突声明

所有作者声明不存在任何利益冲突。

致谢

本研究获得信州大学教育研究支持基金（2019-2024年度）资助，第一作者同时得到大塚敏美奖学金基金会支持。