用于改良邻近延伸分析的双表位肽内参开发及其在人血浆降钙素原检测中的应用

《Journal of Microbiological Methods》：Development of a bi-epitope peptide as fail-safe internal control for a modified proximity extension assay and implementation in the detection of procalcitonin in human plasma

本研究针对改良邻近延伸分析(PEA)技术流程中缺乏有效过程监控的难题，创新性设计了一种双表位标签肽段作为内参系统。研究团队通过合成包含双表位标签与氨基酸间隔子的肽段，实现在人血浆样本中与降钙素原(PCT)生物标志物的协同检测。结果表明该内参具备3个数量级的动态检测范围，且与PCT检测无交叉干扰，为蛋白质生物标志物的精准定量提供了可靠的质量控制方案。

　　

在精准医疗时代，蛋白质生物标志物的检测已成为疾病诊断和治疗监测的重要工具。邻近延伸分析（Proximity Extension Assay, PEA）作为一种新兴的检测技术，结合了均相免疫分析的高特异性和实时定量PCR（qPCR）的高灵敏度，在蛋白质组学研究领域展现出巨大潜力。然而，该技术从样本处理到最终qPCR检测的多个环节中，缺乏有效的内部质量控制手段，可能导致检测结果的假阴性或定量偏差，特别是在复杂生物样本如人血浆中，基质效应更可能影响检测的可靠性。

针对这一技术瓶颈，来自法国生物梅里埃公司的研究团队在《Journal of Microbiological Methods》上发表了一项创新性研究。他们开发了一种新型的双表位肽段作为内部对照（Internal Control, IC），旨在为改良的PEA技术提供全流程的质量保证。这种"故障安全"式内参设计，确保从样本加入到最终qPCR的每个技术环节都能得到有效监控，大大提高了检测结果的可靠性。

研究团队采用的关键技术方法包括：设计合成含有双表位标签和氨基酸间隔子的肽段作为内参；将内参肽段加入人血浆样本中进行PEA检测；使用qPCR同时检测内参和降钙素原（Procalcitonin, PCT）生物标志物；评估内参与PCT检测的交叉干扰及与血浆蛋白的相互作用；分析内参检测的动态范围和稳定性。所有实验均使用人工加标的人血浆样本进行验证。

内参肽段的设计与验证

研究人员设计了一种独特的合成肽作为内参，该肽段由两个表位标签通过三个氨基二氧杂辛酸（Amino Dioxa-octanoic Acid）间隔子连接而成。这种结构设计确保了肽段在PEA检测中能够被特异性识别，同时避免与生物标志物检测发生交叉反应。实验结果表明，该内参肽段能够在人血浆样本中稳定存在，且与血浆蛋白无明显相互作用。

内参与PCT的协同检测

研究团队将内参肽段与PCT生物标志物在相同样本中进行协同检测。结果显示，内参信号与PCT信号互不干扰，qPCR检测中未出现交叉扩增现象。这表明内参系统能够在不影响目标生物标志物检测的前提下，提供全程的质量控制。

检测动态范围与稳定性分析

内参肽段的检测动态范围覆盖了3个数量级的浓度变化，满足了临床检测对定量范围的要求。在固定浓度下，内参的Ct值在不同样本中保持稳定，而PCT的Ct值则随着PCT浓度的升高而降低，证明内参系统能够有效区分技术误差与真实的生物标志物浓度变化。

方法学验证

研究进一步验证了该内参系统在PEA检测中的实用性。结果表明，内参的加入不会影响PCT的检测灵敏度和特异性，同时能够监控从样本处理到qPCR检测的全过程，有效识别技术故障。

本研究成功开发了一种基于双表位肽段的内参系统，为PEA技术提供了可靠的质量控制方案。该内参能够在人血浆样本中与PCT生物标志物实现协同检测，且不产生交叉干扰。研究证实内参具有宽动态检测范围和良好稳定性，能够有效区分技术误差与真实的生物标志物浓度变化。这项工作为蛋白质生物标志物的精准检测建立了重要的方法学基础，特别是为临床诊断中关键生物标志物如PCT的可靠检测提供了技术保障。未来，这种内参设计策略有望推广至其他蛋白质检测平台，推动蛋白质组学检测技术的标准化进程。