一种用于在体内感染期间选择性分离无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）细菌RNA的工作流程

《Journal of Microbiological Methods》：A workflow for selective isolation of bacterial RNA from Streptococcus agalactiae during in vivo infection

选择性分离感染小鼠腹腔冲洗液中乳酸乳球菌RNA的方法研究。采用差速离心、选择性渗透裂解宿主细胞及高频珠打碎技术，优化了玻璃珠尺寸（106μm）、均质化时间及菌量参数，在4×10^5 CFU/mL下获得RIN值5.5的合格RNA样本，宿主RNA污染率降低。qRT-PCR证实体内pbsP粘附素基因表达较体外高11倍。该技术为体内细菌基因表达研究提供可靠工具。

　　

阿加塔·法玛（Agata Famà）|杰拉娜·伦蒂尼（Germana Lentini）|亚历西亚·贝尔比利亚（Alessia Berbiglia）|里卡多·加拉索（Riccardo Galasso）|朱塞佩·瓦莱里奥·德·加埃塔诺（Giuseppe Valerio De Gaetano）|弗朗切斯科·科波利诺（Francesco Coppolino）|康切塔·贝纳蒂尼（Concetta Beninati）

意大利墨西拿大学“加埃塔诺·巴雷西”（Gaetano Barresi）成人及发育期人类病理学系

摘要

直接研究感染组织中的细菌基因表达对于理解宿主-病原体相互作用至关重要，然而在体内恢复完整的细菌RNA在技术上仍然具有挑战性。宿主RNA的污染以及细菌转录本的不稳定性常常限制了后续的应用。在这里，我们开发了一种优化的方法，用于从感染的小鼠腹膜冲洗液中选择性分离无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）的RNA。该方法结合了差速离心、真核细胞的选择性渗透裂解以及使用106微米玻璃珠进行的高频机械破碎技术。该流程最大化了RNA的产量和纯度，同时将宿主RNA的污染降至最低。优化实验确定了珠子大小、匀浆时间和细菌投入量等关键参数，使得即使从低至4×10^5 CFU/mL的样本中也能成功回收可检测的细菌RNA。在体内实验中，RNA样品的纯度（A260/280 > 1.8）和完整性（RINe 5.5）均符合要求，适用于后续分析。作为概念验证，定量RT-PCR结果显示，与体外条件相比，无乳链球菌的粘附基因pbsP在体内的表达水平上调了11倍。该方案为从宿主组织中获取细菌RNA提供了一种可重复的方法，有助于开展感染过程中的靶向基因表达研究。虽然该方法尚未达到用于全转录组分析的最佳水平，但它为研究体内的毒力因子表达提供了一个实用的工具，并可适用于其他细菌病原体。