亮氨酸通过抑制线粒体外膜蛋白降解重塑线粒体蛋白质组的营养感应机制

《Nature Cell Biology》：Leucine inhibits degradation of outer mitochondrial membrane proteins to adapt mitochondrial respiration

本研究揭示了亮氨酸通过GCN2-SEL1L轴抑制线粒体外膜蛋白泛素化降解的新机制。研究人员发现亮氨酸通过抑制氨基酸传感器GCN2，降低E3泛素连接酶辅因子SEL1L在线粒体的表达，从而稳定线粒体蛋白输入 machinery组分（如TOMM40），增强线粒体蛋白质组规模和呼吸功能。该发现为代谢性疾病和癌症治疗提供了新靶点。

　　

线粒体作为细胞的能量工厂，其蛋白质组需要根据代谢需求不断重塑。然而，营养信号如何调控线粒体蛋白质周转的问题一直悬而未决。特别是在代谢适应过程中，线粒体外膜（OMM）蛋白质的稳定性调控机制更是知之甚少。这项发表在《Nature Cell Biology》的研究揭示了一个令人惊讶的发现：常见的支链氨基酸亮氨酸竟然能够通过抑制泛素依赖的蛋白质降解途径，稳定线粒体外膜蛋白，从而增强线粒体呼吸功能。

为了深入研究这一现象，研究人员开发了一种创新的报告系统——线粒体定位的泛素融合降解底物（mitoUFD），该系统通过在秀丽隐杆线虫中表达与不可切割泛素融合的绿色荧光蛋白，并将其锚定在线粒体外膜上，从而能够实时监测线粒体外膜蛋白的降解情况。

研究人员利用这一系统进行了大规模的RNA干扰筛选，涵盖了135个氨基酸代谢相关基因。令人惊讶的是，其中67个基因的敲除能够稳定mitoUFD，表明氨基酸代谢对线粒体外膜蛋白降解具有广泛影响。特别值得注意的是，支链氨基酸代谢途径中的多个酶类，包括bcat-1、dld-1、mccc-1等，都出现在筛选的顶级命中基因中。

进一步实验表明，亮氨酸而非异亮氨酸或缬氨酸，能够特异性抑制线粒体外膜蛋白的降解。这种效应依赖于保守的氨基酸传感器GCN2，但不依赖于mTOR信号通路。在人类HEK293细胞中，研究人员也观察到了类似的保守调控机制，表明这一现象在进化上具有高度保守性。

机制研究表明，亮氨酸处理并不影响26S蛋白酶体的整体活性，但显著降低了线粒体外膜蛋白的泛素化水平。通过蛋白质组学分析，研究人员发现亮氨酸特异性降低了E3泛素连接酶辅因子SEL1L在线粒体中的丰度，而在全虫水平上SEL1L的表达没有变化。SEL1L与HRD1（在秀丽隐杆线虫中为SEL-11）形成E3泛素连接酶复合物，已知在内质网相关降解（ERAD）中发挥作用。

研究人员发现SEL-1与线粒体外膜锚定的mitoUFD共分布，并且与mitoUFD的结合比与对照mitoGFP的结合丰富两倍以上。免疫金分析进一步支持了SEL-1同时定位于内质网和线粒体外膜。敲低sel-1或sel-11能够增加mitoUFD底物在线粒体外膜的稳定性，模拟了亮氨酸处理的效果。

为了探究亮氨酸是否调控内源性线粒体外膜蛋白，研究人员进行了蛋白质组学分析。结果显示，亮氨酸处理能够整体增加线粒体和线粒体外膜蛋白质组，而不影响总虫蛋白质组。在翻译被环己酰亚胺（CHX）抑制的情况下，亮氨酸仍然能够增加线粒体外膜蛋白的丰度，表明这种增加是蛋白质降解减少的结果，而非翻译增加。

特别值得注意的是，九个线粒体外膜蛋白在亮氨酸处理后 consistently 上调，其中包括四个与线粒体蛋白质输入和组装相关的蛋白：TOMM-40（TOMM40复合物亚基）、GOP-3（SAMM50，负责TOMM-40组装到TOM复合物中）、MTCH-1（MTCH1/2，介导 transmembrane 蛋白插入线粒体外膜的插入酶）和DNJ-9（DNAJC11，调控蛋白质输入和分选）。这表明亮氨酸处理可能通过增加这些蛋白质输入 machinery 组分的稳定性，增强线粒体蛋白质输入能力。

功能实验表明，亮氨酸处理3小时就能显著提高线虫和人类细胞的线粒体呼吸速率。虽然其他必需氨基酸处理也能轻微增加线粒体呼吸，但亮氨酸的影响最为显著。过表达cdc-48.1（促进线粒体外膜蛋白降解）或gcn-2（氨基酸感应激酶）能够阻止亮氨酸诱导的线粒体呼吸增加。重要的是，急性敲低tomm-40或使用MitoBlock-12（MB-12）抑制线粒体蛋白质输入，都能消除亮氨酸对线粒体呼吸的增强作用，表明线粒体蛋白质输入 machinery 在这一过程中的关键作用。

研究人员还探讨了这一调控通路在生理和病理条件下的意义。他们利用CRISPR-Cas9技术构建了与人类疾病相关的bcat-1(E279K)突变线虫，该突变对应人类BCAT2的E264K突变，会导致BCAT2活性降低和血浆支链氨基酸水平升高。杂合突变线虫显示出更高的mitoUFD水平，表明线粒体外膜蛋白降解减少。虽然单独敲低gcn-2在野生型线虫中不影响繁殖力，但在bcat-1(E279K/+背景下，gcn-2敲低导致繁殖力显著降低，表明BCAA代谢异常使动物对线粒体蛋白质稳态紊乱更加敏感。

在人类肺癌细胞系中，研究人员发现细胞内支链氨基酸水平较高的H2030和H1666细胞系表现出较低的线粒体外膜蛋白泛素化水平。有趣的是，这些细胞对线粒体蛋白质输入抑制剂MitoBlock-12的处理更加敏感，表明BCAA依赖的线粒体外膜蛋白质稳态调控可能影响癌细胞的生存和耐药性。

本研究的关键技术方法包括：在秀丽隐杆线虫中开发了线粒体定位的泛素融合降解报告系统（mitoUFD）；利用RNA干扰技术进行大规模遗传筛选；通过蛋白质组学分析亮氨酸处理对线粒体蛋白质组的影响；使用Seahorse分析仪测量线粒体呼吸功能；采用免疫金标记和电子显微镜技术确定蛋白质定位；利用CRISPR-Cas9技术构建疾病相关突变模型；通过细胞活力测定评估药物敏感性。

研究结果表明，亮氨酸通过抑制GCN2激酶，降低线粒体相关SEL1L的表达，从而减少线粒体外膜蛋白的泛素化和降解。这一机制稳定了线粒体蛋白质输入 machinery的关键组分（如TOMM40），扩大了线粒体蛋白质组规模，特别是那些参与代谢和呼吸链的蛋白质，最终增强了线粒体呼吸能力。

讨论部分强调，这项研究揭示了一个全新的营养感应机制，通过该机制，细胞质中的营养状态直接调控线粒体外膜蛋白质稳态，作为快速响应来调整线粒体活性。与先前研究的亮氨酸通过SIRT1-AMPK信号通路激活线粒体生物发生的长效机制不同，本研究发现的机制是急性响应，通过调节蛋白质降解而非合成来重塑线粒体蛋白质组。

SEL1L-HRD1复合物在线粒体外膜的特异性作用为理解线粒体蛋白质质量控制增添了新的维度。虽然SEL1L是膜结合蛋白并与线粒体共分布，但它缺乏明显的线粒体靶向序列，这提出了一个有趣的问题：这个E3连接酶复合物是如何被靶向到线粒体外膜的？内质网-线粒体接触位点可能在这一过程中发挥作用，这值得进一步研究。

这些发现对于理解代谢性疾病和癌症具有重要意义。异常的支链氨基酸代谢和线粒体功能改变与多种疾病相关，包括生殖衰老、肿瘤生长和进展。本研究揭示了BCAA代谢通过维持线粒体外膜蛋白降解和调节线粒体活性，与繁殖力相关联。在肺癌细胞中，BCAA水平直接与线粒体外膜蛋白质稳态和细胞对线粒体输入抑制的抗性相关，这可能为癌症治疗提供新的思路。

总之，这项研究不仅揭示了营养物质直接调控线粒体外膜蛋白质稳态的新机制，还为理解代谢调节与线粒体适应之间的连接提供了重要见解，可能为代谢性疾病和癌症的治疗策略开发提供新的靶点。