Click-code-seq技术揭示人类基因组DNA氧化和脱嘌呤的链偏向性及其在癌症突变与化疗中的作用

《Nature Chemical Biology》：Click-code-seq reveals strand biases of DNA oxidation and depurination in human genome

本研究针对单核苷酸精度定位复杂基因组中DNA修饰的技术挑战，开发了升级版click-code-seq方法，首次实现人类基因组氧化损伤和脱嘌呤位点的高精度测绘。团队通过建立快速定量DNA修饰的荧光检测技术click-fluoro-quant，结合新型测序接头MoDIS，显著降低假阳性并实现修饰频率评估。研究发现内源性DNA氧化谱与氧化应激相关的癌症突变特征SBS18高度匹配，化疗药物irofulven优先诱导ApA二聚体启动子区脱嘌呤，且转录链的氧化鸟嘌呤和脱嘌呤位点呈现表达水平依赖性的链偏向性分布。该工作为解析DNA修饰在细胞生理学和毒理学响应中的机制提供了重要技术支撑。

　　

在基因组稳定性研究领域，DNA修饰作为衰老、神经退行性变和癌变的关键驱动因素，其精准定位始终面临技术瓶颈。传统方法难以在单核苷酸水平解析复杂基因组中氧化损伤和脱嘌呤位点的分布规律，导致对不同研究中链偏向性等关键现象的解释存在矛盾。随着化疗药物通过诱导DNA损伤发挥疗效的机制日益受关注，如何在基因组尺度揭示药物作用模式成为毒理学研究的重要挑战。

本研究通过技术方法创新突破了这一困境。研究人员升级了点击化学辅助的DNA修饰测绘策略click-code-seq，开发了配套的荧光定量方法click-fluoro-quant，并设计新型测序接头MoDIS有效区分扩增假象。利用人类慢性髓系白血病细胞系HAP1和骨肉瘤细胞系U2OS，团队系统分析了内源性氧化损伤、化疗药物irofulven诱导及内源性脱嘌呤的基因组分布特征。

快速定量DNA修饰的技术优化

Click-fluoro-quant通过酶切转化与荧光标记实现3.5小时内精准定量8-oxoG、脱嘌呤位点(AP sites)和DNA断裂。该方法在线性检测范围内有效区分不同修饰类型，并优化出ddNTP封闭策略显著降低背景噪音。实验证实超声破碎前完成标记可避免人为损伤，为高通量测序奠定基础。

DNA氧化的序列上下文依赖性

单核苷酸分辨率图谱显示内源性鸟嘌呤氧化与COSMIC数据库突变特征SBS18高度相似（余弦相似度0.929-0.932），证实该癌症特征源于活性氧(ROS)损伤。值得注意的是，CpG二核苷酸位点的氧化水平显著低于其他序列背景，但DNA甲基化状态抑制剂实验表明该现象与胞嘧啶甲基化无关。

药物诱导脱嘌呤的序列偏好性

Irofulven暴露使AP位点增加5倍，点击化学测序揭示其优先发生在腺嘌呤二聚体（AAN三核苷酸）。修饰谱与肾癌相关突变特征SBS40b高度匹配（余弦相似度0.847-0.916），提示该类肿瘤可能暴露于类似irofulven的烷化剂。内源性脱嘌呤则主要发生在GGA/AGA序列，与未知病因的突变特征SBS39/SBS40a相似。

染色质状态与复制时序关联

在100-kbp分辨率下，DNA氧化水平与染色质开放特征（如DNase I超敏位点、H3K4me3等）呈正相关，但在1-kbp局部区域相关性消失。复制时序(Repli-seq)分析显示修饰富集于早期复制区，内源性损伤呈现弱的滞后链模板偏向性，提示单链DNA暴露的影响。

转录相关的链偏向性机制

基因表达水平分析发现显著链不对称分布：高表达基因非转录链的氧化鸟嘌呤富集程度比转录链高14.6%，irofulven诱导的腺嘌呤脱嘌呤在非转录链富集27.3%。这种偏向性贯穿基因体并延伸至转录终止下游，但在启动子上游5-kbp区域出现反向偏倚。该模式与转录泡暴露非转录链的机制一致，同时转录偶联核苷酸切除修复(TC-NER)可能参与irofulven加合物的链特异性清除。

线粒体DNA的链不对称损伤

线粒体DNA重链（-链）呈现内源性鸟嘌呤氧化和腺嘌呤脱嘌呤的显著富集，与链置换复制模型中旧链暴露机制相符。D-loop区G16103和A16104位点的损伤峰值提示其可能参与7S DNA合成终止调控。

这项研究通过多维度的基因组测绘揭示了DNA修饰分布的基本规律，建立了突变特征与化学损伤的直接关联。技术层面，MoDIS接头设计有效解决低丰度修饰检测中的扩增假象难题，ddNTP封闭策略显著提升信噪比。生物学意义上，转录和复制过程中DNA单链状态对损伤分布的塑造作用，为理解DNA稳定性维持机制提供了新视角。发现irofulven与肾癌突变特征SBS40b的关联，为环境暴露与癌症病因学研究开辟了新路径。该成果发表于《Nature Chemical Biology》标志着DNA修饰测绘技术迈向单核苷酸精度的新纪元，为精准毒理学和癌症治疗研究提供了关键技术支撑。