超声增强锰基单原子纳米酶联合钙离子介导疗法的肿瘤治疗新策略

《Materials Today Bio》：Engineered calcium carbonate-modiated SAzymes with Mn-based single-atom sites for ultrasound-enhanced nanocatalytic therapy

本研究针对肿瘤微环境(TME)限制纳米催化疗效的难题，开发了CaCO3包覆的Mn基单原子纳米酶(CaCO3@Mn-UiO-66-NH2, CUM)。该体系在酸性TME中可触发Ca2+释放引发钙超载死亡，同时通过过氧化物酶(POD)样活性催化H2O2生成·OH，超声(US)辐射通过空化效应进一步增强催化效率。体内外实验证实其可通过双模态成像引导实现协同抗肿瘤效果，为肿瘤精准治疗提供了新思路。

　　

癌症作为全球第二大死因，其治疗面临肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)复杂性的严峻挑战。传统治疗方式如手术、化疗和放疗存在疗效有限且副作用大的问题，而新兴的光热治疗(photothermal therapy, PTT)、光动力治疗(photodynamic therapy, PDT)和声动力治疗(sonodynamic therapy, SDT)等也因TME的独特生理屏障（如酸性pH、高过氧化氢H₂O₂浓度、缺氧等）而难以发挥理想效果。纳米酶(nanozyme)因其高稳定性和可调控的催化活性，在肿瘤催化治疗中展现出潜力，尤其是单原子纳米酶(single-atom nanozymes, SAzymes)具有原子利用率高和活性位点明确的特点。锰(Mn)基纳米酶因其多价态氧化还原特性，在模拟天然酶（如过氧化物酶peroxidase, POD）方面具有独特优势。然而，如何实现肿瘤特异性递送并协同多种治疗模态仍是当前研究的难点。

针对这一挑战，发表在《Materials Today Bio》上的研究设计了一种新型的碳酸钙介导的锰基单原子纳米酶(CaCO₃@Mn-UiO-66-NH₂, CUM)，用于超声增强的纳米催化-钙离子超载协同治疗。该研究通过将Mn单原子位点锚定在UiO-66-NH₂金属有机框架(metal-organic framework, MOF)上，并外包覆pH响应的CaCO₃壳层，构建了具有双模态成像引导功能的智能纳米平台。在酸性TME中，CaCO₃壳层降解释放Ca²⁺引发钙介导的细胞死亡(calcium-mediated cell death)；同时，Mn单原子位点发挥POD样活性，催化TME内源性H₂O₂产生高毒性的羟基自由基(hydroxyl radical, ·OH)，并且超声辐照通过空化效应(cavitation effect)进一步提升其催化效率。该研究通过系统的体内外实验验证了CUM的有效性和生物安全性，并利用基因组学分析揭示了其作用的分子通路，为发展高效、精准的肿瘤协同治疗策略提供了新途径。

研究采用了几项关键技术方法：通过溶剂热法和气体扩散法合成具有核壳结构的CUM纳米材料；利用球差校正高角环形暗场扫描透射电子显微镜(AC HAADF-STEM)、X射线吸收近边结构(XANES)和扩展X射线吸收精细结构(EXAFS)等技术表征Mn的单原子配位结构；通过体外催化实验和电子自旋共振(ESR)检测纳米酶的POD样活性和活性氧(ROS)产生能力；使用小鼠乳腺癌细胞(4T1细胞)和小鼠成纤维细胞(L929细胞)进行体外细胞毒性、细胞凋亡、线粒体膜电位和细胞内钙离子浓度等检测；建立4T1肿瘤荷瘤小鼠模型进行近红外二区(NIR-II)荧光成像和磁共振成像(MRI)引导的体内分布、治疗 efficacy 和生物安全性评价；并通过RNA测序(RNA sequencing)进行生物信息学分析以探讨治疗机制。

3.1. CUM的制备与表征

研究人员成功合成了以UiO-66-NH₂ MOF为核心、Mn为单原子位点、CaCO₃为外壳的CUM纳米颗粒。透射电子显微镜(TEM)和扫描电子显微镜(SEM)显示CUM具有均匀的核壳结构，粒径约为230纳米。X射线衍射(XRD)、X射线光电子能谱(XPS)和傅里叶变换红外光谱(FT-IR)等表征手段证实了Mn单原子成功配位到MOF骨架上，并且CaCO₃壳层完整包覆。热重分析表明CUM中CaCO₃壳层的存在。这些结果证明了CUM的成功制备及其结构的稳定性。

3.2. CUM的局部电子结构与配位信息

通过AC HAADF-STEM直接观察到了CUM中原子级分散的Mn单原子。XANES和FT-EXAFS分析表明Mn在CUM中以Mn-N配位形式存在，不同于Mn箔、MnO和MnO₂中的配位环境，证实了单原子位点的形成。密度泛函理论(Density functional theory, DFT)计算进一步揭示了Mn原子优先与UiO-66-NH₂配体中的氨基(-NH₂)配位。这些分析从原子尺度明确了CUM的活性中心结构。

3.3. Ca²⁺释放与CUM的单原子纳米酶性能

体外释放实验表明，CUM在酸性条件(pH 5.0和6.5)下能快速释放Ca²⁺，而在生理pH (7.4)下释放缓慢，展现了其良好的pH响应性。酶动力学实验证明CUM具有显著的POD样活性，能够催化H₂O₂氧化3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)并产生·OH。超声辐照可显著增强其催化活性，表现为米氏常数(K_m)降低和最大反应速率(V_max)增加。此外，CUM还能消耗谷胱甘肽(GSH)，破坏肿瘤细胞的抗氧化防御体系。CUM在不同生理介质中表现出良好的胶体稳定性。

3.4. CUM的体外抗肿瘤效果

细胞实验表明，CUM对正常L929细胞毒性低，显示出良好的生物相容性。而对4T1肿瘤细胞，CUM+US处理表现出剂量依赖性的细胞毒性，半抑制浓度(IC₅₀)约为120 μg/mL。激光共聚焦显微镜(CLSM)和流式细胞术检测发现，CUM能被4T1细胞有效摄取，并在细胞内酸性环境下释放Ca²⁺，导致细胞内钙离子浓度升高。同时，使用2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)探针检测到CUM处理组细胞内ROS水平显著升高。活/死细胞染色和Annexin V-FITC/PI凋亡检测结果显示，CUM+US处理能诱导大量肿瘤细胞死亡。JC-1染色表明CUM处理导致线粒体膜电位下降，提示线粒体功能障碍。Western blotting分析进一步证实CUM处理可上调促凋亡蛋白Bax和钙蛋白酶(Calpain)的表达，下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。这些结果综合表明CUM通过引发钙超载、ROS爆发和线粒体损伤协同诱导肿瘤细胞凋亡。

3.5. CUM的成像评估

体内成像研究显示，经尾静脉注射后，CUM能通过增强渗透和滞留(enhanced permeability and retention, EPR)效应在肿瘤部位富集。通过负载吲哚菁绿(ICG)进行NIR-II荧光成像，发现CUM在注射后24小时在肿瘤处积累达到峰值。同时，利用Mn的顺磁性进行的T₁加权磁共振成像(MRI)也证实了CUM在肿瘤部位的特异性聚集，并在48小时后开始代谢清除。这些成像结果为确定最佳治疗时间窗提供了依据。

3.6. CUM的体内全身抗肿瘤效力及生物信息学分析

在4T1荷瘤小鼠模型中，CUM+US治疗组表现出最强的肿瘤生长抑制效果，且小鼠体重无明显变化，表明其良好的体内安全性。肿瘤组织苏木精-伊红(H&E)染色和TUNEL染色显示CUM+US组肿瘤细胞出现大量凋亡和坏死。血液生化分析表明CUM未引起明显的肝肾功能损伤。RNA测序分析揭示，与PBS对照组相比，CUM+US处理组有560个差异表达基因(DEGs)，其中376个上调，184个下调。基因本体(Gene Ontology, GO)富集分析表明差异基因主要富集在炎症反应、ROS代谢等生物过程。京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路分析显示，TNF信号通路、p53信号通路和钙信号通路等被显著激活。蛋白质印迹(Western blot)进一步验证了p53和TNF-α蛋白表达的上调。

本研究成功开发了一种具有超声增强催化性能和pH响应性钙离子释放能力的锰基单原子纳米酶CUM。该平台巧妙地将Mn单原子的POD样催化活性与CaCO₃壳层的TME响应特性相结合，实现了钙超载治疗与纳米催化治疗的协同增效。超声辐照不仅增强了纳米酶的催化效率，也为治疗提供了物理激活手段。通过NIR-II荧光成像和MRI双模态成像引导，实现了对纳米药物体内行为的实时监控和治疗时机的精准把握。深入的分子机制研究表明，CUM通过调控ROS代谢、钙信号、p53通路和炎症反应等多个关键生物学过程，有效诱导肿瘤细胞凋亡。该研究为克服TME限制、发展高效低毒的肿瘤协同治疗策略提供了新的思路和实验依据，展示了单原子纳米酶在生物医学应用中的巨大潜力。