HSV-1糖蛋白B的预融合结构、逃避机制及其中和方法

《Nature Microbiology》：Prefusion structure, evasion and neutralization of HSV-1 glycoprotein B

本研究通过结构设计稳定了HSV-1 gB的预融合构象，并分离出特异性中和抗体WS.HSV-1.24，但免疫实验显示其无法有效中和病毒。分析表明，预融合构象的表面暴露与后融合构象相似，且gB通过结构可塑性逃避免疫。

　　在病毒侵入宿主细胞的过程中，融合蛋白发挥着至关重要的作用。其中，疱疹病毒的糖蛋白B（gB）作为一类III型融合蛋白，其在侵入前与侵入后构象之间的构象变化对于病毒的感染过程至关重要。然而，针对gB的预融合特异性中和抗体的分离一直是一个挑战。这项研究通过结构导向设计，成功稳定了HSV-1 gB的预融合构象，并利用冷冻电镜（cryo-EM）解析了gB的构象结构，同时分离出了一种具有预融合特异性的中和抗体WS.HSV-1.24。研究还发现，虽然免疫小鼠能够产生针对预融合和后融合gB的高滴度抗体，但这些抗体无法有效中和HSV-1。通过分析表面可及性、氢-氘交换/质谱（HDX-MS）以及gB的构象变化，研究揭示了gB在预融合构象中通过等表面暴露和结构可塑性来逃避中和抗体的作用。研究进一步指出，WS.HSV-1.24通过识别gB在预融合构象中的特定域间重折叠区域，从而实现中和效果。这些发现表明，HSV-1 gB的构象变化可能影响其对中和抗体的敏感性。

### 病毒融合机制与免疫逃逸

病毒在侵入宿主细胞时，通常会利用融合蛋白来促进病毒包膜与靶细胞膜的融合。这一过程需要融合蛋白经历构象变化，从预融合状态转变为后融合状态。例如，HIV-1、流感病毒和呼吸道合胞病毒（RSV）的融合蛋白在预融合状态下具有较高的中和抗体敏感性。这些融合蛋白的预融合构象被证明是中和抗体的主要靶点，因此疫苗开发通常会利用这种构象的稳定性来设计抗原。然而，HSV-1的gB蛋白却表现出不同的特性，即使在预融合构象下，也难以被中和抗体有效识别。这可能与gB的结构可塑性和表面可及性有关。

### HSV-1 gB的结构与功能

HSV-1 gB由五个不同的结构域（DI–DV）组成，这些结构域在预融合和后融合构象中表现出显著的构象变化。通过结构导向设计，研究者引入了一系列突变，如H516P和L531E，以稳定gB的预融合构象。同时，通过引入人工二硫键（如A240C和E607C），进一步限制了结构域的构象变化。研究结果显示，这些突变能够显著改变gB的构象，使其更接近预融合状态。

在冷冻电镜分析中，研究者确定了预融合gB的结构，并发现其与后融合gB的表面可及性存在显著相似性。这表明，gB的预融合构象与后融合构象之间存在“等表面”暴露现象，即预融合gB的可及表面在后融合构象中同样暴露。这一现象可能使得抗体难以区分预融合和后融合构象，从而无法有效中和病毒。

此外，gB的预融合构象中存在大量的N-连接糖基化位点，这些糖基化位点可能在一定程度上掩盖了某些抗原表位，使得中和抗体难以识别。例如，糖基化位点N141和N430可能在后融合构象中起到重要作用，但这些区域在预融合构象中被糖基化掩盖，从而降低了抗体的识别能力。这一发现进一步支持了gB通过糖基化屏蔽来逃避中和抗体的假设。

### 中和抗体的识别机制

研究中分离出的WS.HSV-1.24抗体具有预融合特异性，并能够中和HSV-1和HSV-2。通过冷冻电镜分析，发现该抗体识别gB的DI和DII结构域之间的特定区域，这些区域在预融合构象中表现出较低的表面遮蔽和较高的可及性。此外，研究还发现，D48抗体能够诱导gB从预融合构象向后融合构象的转变，从而中和病毒。这一机制表明，某些中和抗体可能通过诱导融合蛋白的构象变化来实现中和作用。

### 与其它病毒融合蛋白的比较

与RSV和HIV-1等病毒的融合蛋白不同，HSV-1的gB表现出较高的结构可塑性。例如，在RSV的融合蛋白F中，某些关键的抗原表位在预融合构象中暴露，使得中和抗体能够有效识别。然而，HSV-1的gB在预融合构象中，这些关键表位可能被糖基化或其他结构变化所掩盖，导致中和抗体无法有效识别。因此，HSV-1 gB的免疫逃逸机制可能不同于其他病毒的融合蛋白。

### 未来研究方向

研究者指出，HSV-1 gB的预融合构象可能并不适合作为疫苗抗原，除非能够提高其关键抗原表位的暴露程度。这可能需要采用特定的疫苗设计策略，如表位聚焦（epitope focusing），即通过首先引发对特定表位的免疫反应，再通过预融合构象的抗原增强中和抗体的识别能力。此外，还需要进一步研究WS.HSV-1.24抗体是否能够通过诱导gB的构象变化来实现中和作用，以及其在动物模型和人类中的免疫保护效果。

### 实验方法与技术

为了研究gB的构象变化和中和抗体的识别机制，研究者采用了多种实验技术。首先，通过冷冻电镜（cryo-EM）解析了gB的结构，并结合氢-氘交换/质谱（HDX-MS）分析了其表面可及性和构象变化。其次，利用表面等离子体共振（SPR）和酶联免疫吸附测定（ELISA）评估了不同构象的gB与抗体的结合能力。此外，还通过细胞表面识别实验验证了抗体对HSV-1 gB的结合效果。

研究中还采用了分子动力学模拟来分析gB的结构变化和糖基化屏蔽效应。通过这些技术，研究者能够更全面地理解gB的结构和功能，以及其在免疫逃逸中的作用。同时，研究者还对gB的结构域进行了详细的分析，包括其在预融合和后融合状态下的构象变化、表面可及性以及糖基化位点的分布。

### 结论

本研究揭示了HSV-1 gB在预融合构象中通过等表面暴露和结构可塑性来逃避中和抗体的机制。尽管预融合构象在其他病毒的融合蛋白中是中和抗体的主要靶点，但HSV-1 gB的结构特性使得这一策略在疫苗开发中面临挑战。因此，未来的研究需要探索新的疫苗设计方法，以克服HSV-1 gB的免疫逃逸特性，从而开发出有效的疫苗和治疗手段。此外，还需要进一步研究WS.HSV-1.24和D48等中和抗体的识别机制，以及它们在不同病毒株中的中和效果。这些研究将有助于更深入地理解HSV-1的免疫逃逸机制，并为抗疱疹病毒的疫苗和治疗策略提供新的思路。