环境基质中致病性耶尔森菌现场监测：一种经济高效的LAMP检测新方法的开发与验证

《Science in One Health》：Development of a cost-effective LAMP method for screening and monitoring enteropathogenic Yersinia in environmental matrices

本文推荐一种用于环境和现场监测致病性耶尔森菌的环介导等温扩增（LAMP）方法。研究人员针对耶尔森菌假结核复合体（含鼠疫耶尔森菌）的mglB基因和肠道耶尔森菌的chbG基因，开发了特异性LAMP检测体系。该方法灵敏度达103 CFU，成功应用于28份阿尔及利亚环境样本检测，并与PCR结果一致，证明其快速、经济、适于现场部署，对耶尔森菌病及瘟疫防控具有重要意义。

　　

在自然界的水体、土壤乃至我们食用的蔬菜中，潜藏着一类名为耶尔森菌（Yersinia）的细菌。它们中的少数成员，如肠道耶尔森菌（Yersinia enterocolitica）和假结核耶尔森菌（Yersinia pseudotuberculosis），能引起急性肠炎；而更为凶险的，是由假结核耶尔森菌演化而来的鼠疫耶尔森菌（Yersinia pestis），它是引发致命性瘟疫的元凶。这些病原体在环境中的存在，构成了动物和人类感染的潜在源头。因此，开发能够在现场快速、可靠地监测这些病原体的技术，对于预警和防控相关疾病至关重要。然而，传统的实验室检测方法，如聚合酶链式反应（PCR），虽然灵敏特异，但需要复杂的仪器设备和专业的操作人员，难以在资源有限的现场环境中广泛应用。尽管环介导等温扩增（Loop-mediated Isothermal Amplification, LAMP）技术因其快速、无需热循环仪等优点被视为有前景的现场检测工具，但此前的研究多停留在实验室验证阶段，缺乏直接应用于环境样本并证明其可行性的系统性方案。

为了解决这一难题，来自法国马赛感染病医学研究所（IHU-Méditerranée Infection）的研究团队开展了一项研究，旨在开发一种集成的、适用于现场的一站式检测方案，用于环境基质中致病性耶尔森菌的监测。他们的研究成果发表在《Science in One Health》上，题为“Development of a cost-effective LAMP method for screening and monitoring enteropathogenic Yersinia in environmental matrices”。

为了达成研究目标，研究人员运用了几项关键的技术方法。首先，他们利用生物信息学工具，对来自美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库的耶尔森菌假结核菌和肠道耶尔森菌的全基因组序列（Whole Genome Sequence, WGS）进行了深入分析，并辅以自行测序的菌株，构建了泛基因组，从而筛选出高度保守的特异性靶基因。其次，他们基于选定的靶基因，运用专业的引物设计软件，为LAMP检测精心设计了多对引物。第三，他们建立并优化了颜色判读的LAMP扩增体系，该体系在恒温（65°C）下短时间内（30-45分钟）即可完成反应，结果通过溶液颜色变化（黄色为阳性，粉色为阴性）直观判断。最后，他们将优化后的LAMP方法应用于从阿尔及利亚两个瘟疫流行区和一个非疫区采集的28份环境样本（包括土壤、植物根茎和啮齿动物粪便），并与传统PCR方法进行对比验证，同时通过人工添加标准菌株的方式评估了环境样本中可能存在的抑制物影响。

3.1. 基于耶尔森菌全基因组序列的引物设计

研究人员通过对自行测序的肠道耶尔森菌Q7480、Q8179菌株和假结核耶尔森菌P6349菌株进行比较基因组学分析，确认它们与NCBI中的参考基因组具有高度相似性（96%-100%）。通过对23株肠道耶尔森菌和26株假结核耶尔森菌参考基因组的泛基因组分析，他们从大量保守基因中，最终选定了假结核耶尔森菌/鼠疫耶尔森菌共有的mglB基因（编码D-半乳糖结合周质蛋白）和肠道耶尔森菌特有的chbG基因（编码几丁寡糖脱乙酰酶）作为LAMP检测的靶点。生物信息学分析表明，这两个基因在各自目标菌种的已知完整基因组中高度保守。随后，他们针对mglB和chbG基因序列，分别设计了包含外引物（F3, B3）、内引物（FIP, BIP）和环引物（LF, LB）在内的全套LAMP引物。

3.2. LAMP扩增

特异性验证结果显示，新设计的引物能够特异性地检测目标菌株（假结核耶尔森菌P6349对mglB引物；肠道耶尔森菌Q7480对chbG引物），而对其他非目标耶尔森菌种（如Yersinia bercovieri, Yersinia intermedia, Yersinia timonensis）均无交叉反应（但Y. enterocolitica subsp. palearctica对chbG引物呈阳性，符合预期）。灵敏度测试表明，该LAMP方法对纯培养的耶尔森菌假结核菌和肠道耶尔森菌的检测限均可达10³ CFU。与传统PCR相比，LAMP检测结果一致，且更快速简便。

3.3. 环境基质中的LAMP检测

将建立的LAMP方法应用于28份实地采集的环境样本时，无论是来自瘟疫流行区还是非疫区的样本，LAMP和PCR检测结果均为阴性，未发现耶尔森菌。为了确认环境样本本身不存在抑制LAMP反应的物质，研究人员在每份样本中人工添加了高浓度的耶尔森菌假结核菌或肠道耶尔森菌。结果显示，所有“加标”样本均能通过LAMP被有效检出，证明了该方法在面对复杂环境基质时的可靠性，排除了假阴性的可能。

本研究成功开发了一种针对环境基质中致病性耶尔森菌的LAMP检测方法。研究结论指出，这项基于特异性靶基因mglB和chbG的LAMP检测技术，为在现场监测点（Points of Interest, POI）对医学和兽医学上重要的耶尔森菌（特别是耶尔森菌假结核复合体和肠道耶尔森菌）进行时空动态监测提供了概念验证。与以往主要针对毒力基因或未应用于环境样本的LAMP研究相比，本研究的特点在于其系统性的生物信息学靶点筛选、严格的实验室验证以及直接的环境样本应用。该方法具有快速（30-90分钟完成DNA提取和扩增）、经济（无需昂贵热循环仪）、操作简便（结果肉眼可判读）以及对现场环境适应性强的潜在优势。讨论部分进一步强调了该技术的重要意义：对于像鼠疫这样的人兽共患病，了解病原体在环境中的储存和分布是揭示传播链的关键环节。例如，有研究表明，骆驼等动物可能通过摄食被污染的环境物质而感染鼠疫耶尔森菌。此外，人类因接触或食用感染动物也曾导致肠炎甚至致命性鼠疫的暴发。因此，能够快速、经济地在现场监测环境中的病原体，对于早期预警和预防控制耶尔森菌病及瘟疫在流行国家的发生和传播具有重要的实用价值。尽管本次实地采样未检出阳性结果，但该方法为后续更广泛的现场应用奠定了坚实基础。研究人员也指出，未来在非受控的现场条件下，环境样本的物理化学特性等因素对检测灵敏度的影响仍需进一步评估。总体而言，这项研究为开发适用于现场、成本效益高的病原体监测工具提供了有价值的范本。