新型裂解性大肠杆菌噬菌体vB_EcoS_P78的分离鉴定及其对多重耐药菌的抗菌潜力研究

《Virus Research》：Isolation and characterization of a novel lytic bacteriophage vB_EcoS_P78 against multidrug-resistant Escherichia coli

本研究针对多重耐药大肠杆菌(MDR E. coli)感染日益严峻的临床挑战，从猪粪便中分离出一株新型裂解性噬菌体vB_EcoS_P78。研究通过形态学、基因组学及功能实验证实该噬菌体属于Dhillonvirus属新物种，对75%的产ESBL（超广谱β-内酰胺酶）和MDR大肠杆菌临床分离株具有高效裂解能力，且具备良好的温度(≤50°C)和pH(3-10)稳定性。其短潜伏期(20分钟)和高爆发量(220 PFU/细胞)展现出治疗潜力，全基因组分析未发现耐药性及毒力基因，为开发抗多重耐药菌的噬菌体疗法提供了安全候选株。

　　

随着抗生素滥用问题日益严重，多重耐药菌（Multidrug-Resistant Organisms, MDRO）的蔓延已成为全球公共卫生领域的重大挑战。其中，产超广谱β-内酰胺酶（Extended-Spectrum Beta-Lactamase, ESBL）的大肠杆菌（Escherichia coli）尤其令人担忧，这类细菌能够水解青霉素类和头孢菌素类抗生素，导致传统治疗方案失效。在畜牧养殖业中，猪源性大肠杆菌的传播更可能通过食物链向人类扩散耐药基因，形成潜在的生态健康威胁。面对这一困境，科学家们将目光投向了一种古老的“细菌天敌”——噬菌体（Bacteriophage）。这些专一性感染细菌的病毒具备精准裂解耐药菌的能力，且不会破坏人体正常菌群，因而被视为后抗生素时代的重要替代疗法。

近期发表于《Virus Research》的一项研究，报道了一株具有广泛应用潜力的新型噬菌体——vB_EcoS_P78。该噬菌体分离自家猪粪便样本，以临床分离的多重耐药大肠杆菌A78作为宿主进行富集和纯化。研究人员通过系统的生物学特性分析、全基因组测序和比较基因组学方法，全面评估了其形态特征、宿主范围、稳定性、复制动力学及系统分类地位，为开发针对多重耐药大肠杆菌的噬菌体疗法提供了重要的理论依据和实验材料。

在技术方法方面，作者采用传统噬菌体分离与纯化技术（包括双层琼脂平板法、聚乙二醇沉淀等），结合现代分子生物学手段完成全基因组测序（Illumina NovaSeq 6000平台）和功能注释。通过透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）观察病毒颗粒形态，利用点斑法和一步生长曲线测定其宿主范围与复制参数，并借助生物信息学工具（如VIRIDIC、MAFFT、IQ-TREE）进行系统发育分析和基因组比较。所有实验均设置三次生物学重复，数据经GraphPad Prism 10.0进行统计学处理。

3.1. vB_EcoS_P78的形态特征

透射电镜显示该噬菌体具有典型的短尾噬菌体（Siphoviridae）形态，头部呈二十面体结构，直径约47纳米，尾部长约97纳米。在双层琼脂平板上可形成直径约4毫米的透明空斑，表明其具有较强的裂解能力。

3.2. vB_EcoS_P78的宿主范围测定

研究测试了8株临床分离的多重耐药大肠杆菌（包括5株ESBL阳性菌和3株MDR菌），发现vB_EcoS_P78可裂解其中6株（75%），覆盖O1、O3、O8、O11、O55等多种血清型，且对应序列型（Sequence Type, ST）包括ST58、ST354、ST10和ST542，显示其具有较宽的裂解谱。

3.3. 温度稳定性测试

噬菌体在50°C以下处理2小时后仍保持较高活性，60°C时滴度开始下降，80°C时仍有部分存活，表明其具备良好的热稳定性。

3.4. pH稳定性测试

在pH 5.0–10.0范围内孵育2小时，噬菌体存活率超过92.5%；在pH 3.0时活性中度下降，极端酸性（pH 1.0）或强碱性（pH 12.0）条件下则显著失活。

3.5. 最佳感染复数（Multiplicity of Infection, MOI）

通过比较不同MOI（0.001–10）下的噬菌体增殖效果，确定MOI=1时可获得最高效价（4×10¹⁰ PFU/mL）。

3.6. 一步生长曲线

vB_EcoS_P78的潜伏期为20分钟，爆发期持续40分钟，平均每个感染细胞可释放约220个噬菌体颗粒，显示其具有快速复制和高产出的特性。

3.7. 噬菌体体外溶菌试验

在体外共培养实验中，vB_EcoS_P78能显著抑制肠出血性大肠杆菌（Enterohemorrhagic E. coli, EHEC）的生长，与对照组相比，实验组细菌浓度（OD₆₀₀）始终维持在较低水平。

3.8. vB_EcoS_P78的基因组特征

全基因组为44,574 bp的双链DNA，GC含量54.72%，共预测到58个开放阅读框（Open Reading Frames, ORFs），未检测到抗生素耐药基因、毒力基因或tRNA。基因组模块化结构明显，包含编码头部/尾部蛋白、DNA代谢与复制、以及裂解系统（内溶素、两个holin蛋白和一个Rz-like spanin蛋白）的功能基因簇。

3.9. vB_EcoS_P78的系统发育分析

通过全基因组相似性比较（VIRIDIC）和基于主要衣壳蛋白（Major Capsid Protein, MCP）及末端酶大亚基（Terminase Large Subunit, TerL）构建的系统发育树，均支持将vB_EcoS_P78归类为Dhillonvirus属的新物种，与其最接近的噬菌体Escherichia phage JL1基因组相似性为92.8%，低于ICTV设定的物种界定阈值（95%）。

综合讨论与结论部分指出，vB_EcoS_P78作为一种新型裂解性噬菌体，在对抗多重耐药大肠杆菌方面展现出显著潜力。其宽宿主范围、优良的环境适应性、高效的复制能力以及基因安全性（不携带耐药或毒力基因），均满足噬菌体疗法的基本要求。特别是其裂解模块中独特的双holin蛋白组合，可能有助于增强对细菌细胞膜的破坏效率，这为理解其高效溶菌机制提供了新线索。尽管该研究尚未开展动物体内实验，且宿主范围有待在更广泛的临床菌株中验证，但现有数据已充分表明vB_EcoS_P78是开发抗多重耐药菌制剂的有力候选者。未来如能进一步探索其与抗生素的协同效应、开展体内药效与安全性评价，将有力推动其向临床应用的转化。