人类TRPM4通道激活、脱敏和抑制的机制景观

《Nature Structural & Molecular Biology》：Structural landscape of activation, desensitization and inhibition in the human TRPM4 channel

TRPM4通道的构象动态与调控机制研究通过单粒子冷冻电镜解析了Ca2?、PtdIns(4,5)P?和ATP作用下的四种构象（apo closed、Ca2?结合态、Ca2?-PtdIns(4,5)P?结合开放态和ATP抑制态），揭示了激活需Ca2?结合及PtdIns(4,5)P?稳定，失活由ATP抑制通道构象，并阐明了膜磷脂和细胞信号分子对通道状态的动态调控机制，为神经系统疾病和癌症治疗提供新靶点。

　　TRPM4，全称为瞬时受体电位-黏蛋白（TRPM）通道家族的一员，是一种由钙离子（Ca2?）激活的单价阳离子选择性通道。这种通道广泛分布于多种细胞和组织中，其激活能够引起细胞膜电位的去极化，并调控多种依赖钙离子的生物过程。TRPM4的活性受到膜磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PtdIns(4,5)P?）的增强以及细胞质中的腺苷三磷酸（ATP）的抑制，使得该通道能够根据细胞内钙离子、ATP和PtdIns(4,5)P?水平的动态变化，在不同的功能状态间切换。本研究通过单颗粒冷冻电镜技术，获得了人类TRPM4在四种不同状态下的结构：无配体的闭合状态、Ca2?结合的可能失敏状态、Ca2?与PtdIns(4,5)P?结合的开放状态以及ATP结合的抑制状态。结合突变和电生理分析，这些结构揭示了TRPM4激活、失敏和抑制的分子机制。鉴于钙离子、PtdIns(4,5)P?和ATP在细胞信号传导中的核心作用，这项工作为解析TRPM4在多种生物系统中的生理功能提供了结构基础。

TRPM4是TRP通道家族中最大的亚家族之一，由四个内源性的N端melastatin同源结构域（MHR1–MHR4）和S1–S6跨膜结构域组成，其中TRP结构域、一个核糖螺旋和一个螺旋结构形成一个四螺旋束，构成了一个四聚体通道。某些家族成员还包含一个额外的酶结构域，位于C端。在TRPM亚家族的八个成员中，TRPM4和TRPM5在序列同源性和生物物理特性上具有高度相似性，包括钙离子激活和单价阳离子传导。TRPM5主要存在于味觉受体细胞中，而TRPM4则广泛表达于大脑、胰腺、肾脏和心脏，以及免疫细胞和中枢神经系统中。因此，TRPM4在许多生理过程中发挥重要作用，如胰岛素分泌、免疫反应、细胞死亡和心脏传导等。TRPM4的突变与多种心脏功能障碍有关，包括房室传导阻滞、进行性家族性心脏阻滞I型、Brugada综合征和长QT综合征等。值得注意的是，TRPM4已被证明能够通过促进细胞内钠离子的流入直接调控细胞坏死过程，进而导致细胞肿胀和破裂。由于TRPM4在多种癌细胞中的表达上调，它已成为新兴癌症治疗研究的焦点，通过促进癌细胞的坏死来抑制其生长。

TRPM4的激活和调节机制在细胞信号传导中具有重要意义。TRPM4的激活主要依赖于细胞质中的钙离子，同时受到PtdIns(4,5)P?和ATP的调控。PtdIns(4,5)P?通过增强钙离子对TRPM4的激活作用，帮助该通道保持开放状态。然而，当细胞膜中的PtdIns(4,5)P?水平降低时，通道可能会失敏。有趣的是，尽管细胞质中的ATP直接作为TRPM4的内源性抑制剂，但Mg2?结合的ATP却能通过缓解通道失敏来增加其活性。这种通道在ATP存在下从失敏状态恢复的过程可能是因为ATP激活了脂质激酶，从而补充了膜中的PtdIns(4,5)P?。

TRPM4的结构在不同状态下已经被部分确定，包括闭合状态、Ca2?结合的可能失敏状态、Ca2?和PtdIns(4,5)P?结合的开放状态以及ATP结合的抑制状态。这些结构涵盖了TRPM4在激活、失敏和抑制过程中的构象景观，提供了关于TRPM4在生理重要信号分子调控下的结构机制的深刻见解。通过这些结构，我们能够更深入地理解TRPM4在不同生理条件下的行为，以及它如何响应细胞内钙离子、ATP和PtdIns(4,5)P?水平的变化。

在TRPM4的结构研究中，我们特别关注了其激活机制。通过将TRPM4在Ca2?和PtdIns(4,5)P?结合的开放状态与无配体的闭合状态进行比较，我们发现钙离子的结合在S1–S4结构域中引发了一系列协同的构象变化。钙离子的结合首先导致S3结构域的N端向结构域中心移动，进而使W864侧链向S4结构域的C端移动。这一运动通过与S4结构域的H908紧密结合，推动S4结构域向S5结构域移动，从而启动了通道的开放过程。此外，S4结构域的移动还促使F910与F935结构域的侧链发生协同旋转，以避免相互碰撞，这种旋转使得F910苯环与F935主链之间形成更广泛的疏水接触，从而推动S5与S4–S5连接区的向上摆动。S6结构域的弯曲运动则进一步促进了通道的开放，同时带动TRP结构域的旋转，最终导致细胞质结构域的向上摆动，形成开放的通道结构。这些构象变化揭示了TRPM4激活过程中各个结构域之间的协同作用。

TRPM4的失敏机制也得到了深入研究。在Ca2?结合的结构中，TRPM4呈现出一种介于开放和闭合状态之间的构象。其S1–S4结构域经历了与开放状态类似的钙离子诱导的局部构象变化，但通道的孔道和细胞质结构域仍保持在闭合状态。这种构象变化可能是由于F910和F935结构域之间的侧链运动，导致钙离子诱导的S4结构域运动与孔道开放之间的解耦。当PtdIns(4,5)P?的稳定作用消失时，通道的孔道区域容易回到闭合状态，从而表现出对钙离子激活的失敏。此外，这种失敏状态的结构特征可能包括一个预开放的中间状态，其中钙离子诱导的构象变化尚未完全传递到孔道，或者是一个后开放的失敏状态，其中孔道及其紧密相关的细胞质结构域恢复到闭合构象。

ATP对TRPM4的抑制作用也得到了详细研究。Mg2?自由的ATP能够通过结合N端的MHR结构域来抑制TRPM4。在Ca2?和PtdIns(4,5)P?激活的TRPM4结构中，ATP的结合会阻止PtdIns(4,5)P?和Ca2?的结合，从而稳定通道在闭合状态。ATP的结合位置与无配体的闭合结构类似，位于相邻亚基的MHR1和MHR3结构域之间的界面。这种结合可能通过增强相邻亚基之间的接触，使得细胞质结构域保持在闭合状态，从而抑制通道的激活过程。ATP的结合可能在结构上类似于一种分子胶，固定了结构域之间的接触，防止了它们在钙离子激活下的构象变化。

通过这些结构的解析，我们能够更全面地理解TRPM4在细胞信号传导中的作用。TRPM4的激活、失敏和抑制过程涉及多个结构域的协同运动，其中钙离子的结合是初始激活的关键。然而，钙离子激活的通道需要PtdIns(4,5)P?的结合才能维持其开放状态。一旦PtdIns(4,5)P?的稳定作用消失，通道的孔道区域可能会回到闭合状态，导致其对钙离子激活的失敏。ATP的结合则通过固定相邻亚基之间的接触，使得细胞质结构域保持在闭合状态，从而抑制通道的激活过程。这些结构特征为TRPM4在多种生理和病理过程中的功能提供了新的视角。

此外，TRPM4的结构研究还揭示了其与其他TRP通道（如TRPM3和TRPM8）之间的相似性和差异性。虽然PtdIns(4,5)P?在TRPM4中的结合模式与TRPM3和TRPM8不同，但其在调控这些通道中的作用是相似的。PtdIns(4,5)P?在TRPM3和TRPM8中的结合可能涉及不同的结构域和结合位点，但其对通道激活的促进作用是共同的。TRPM4的结构研究不仅有助于理解其自身的功能，也为其他TRP通道的结构和功能研究提供了重要的参考。

在实验方法上，我们使用了多种技术手段来获取TRPM4的结构信息。首先，我们通过蛋白表达和纯化获得了完整的TRPM4蛋白。随后，我们利用冷冻电镜技术对TRPM4在不同状态下的结构进行了高分辨率的解析。在数据处理过程中，我们采用了cryoSPARC软件进行三维重构，并通过手动调整和精修来完善模型。此外，我们还结合了电生理实验，以验证TRPM4在不同状态下的功能特性。这些实验包括使用短链合成的PtdIns(4,5)P?（diC8）和ATP进行记录，并通过分析电流-电压曲线（I–V曲线）来评估通道的活性。这些实验不仅验证了结构数据的准确性，还为理解TRPM4在不同配体作用下的行为提供了重要的功能数据。

TRPM4的结构和功能研究具有重要的生理和病理意义。在心脏传导中，TRPM4的异常表达可能导致心律失常和心脏传导障碍。在免疫反应中，TRPM4的激活可能促进细胞坏死，从而影响免疫细胞的活性。在胰岛素分泌中，TRPM4的调控可能与细胞膜的去极化有关。此外，TRPM4在癌症治疗中的应用也引起了广泛关注，因为其能够通过促进细胞坏死来抑制癌细胞的生长。这些研究不仅揭示了TRPM4的分子机制，还为其在医学和生物技术中的应用提供了理论基础。

总之，TRPM4作为一种钙离子激活的通道，在细胞信号传导中发挥着重要作用。其结构和功能研究不仅有助于理解其在不同生理过程中的调控机制，还可能为相关疾病的治疗提供新的思路。通过结合结构生物学和电生理学的研究方法，我们能够更全面地解析TRPM4的激活、失敏和抑制过程，从而揭示其在细胞信号传导中的关键作用。这些发现不仅对基础生物学研究具有重要意义，还可能在医学和生物技术领域带来深远的影响。