L-瓜氨酸通过"肠-睾丸轴"缓解高精料饮食诱导的支持细胞DNA损伤及血睾屏障功能障碍的作用机制研究

《npj Biofilms and Microbiomes》：L-citrulline protects testicular Sertoli cell function by mitigating DNA damage via the gut-testis axis of sheep fed a high-concentrate diet

本研究针对高精料饮食(HCD)导致雄性生殖功能下降的突出问题，通过多组学技术揭示了肠道菌群失调通过影响L-瓜氨酸代谢，进而导致支持细胞DNA损伤和血睾屏障(BTB)功能障碍的新机制。研究人员发现补充L-瓜氨酸可有效修复DNA损伤、改善精子质量，为通过"肠-睾丸轴"干预男性不育提供了新的治疗靶点。

　　

随着现代饮食结构的改变，高热量、高精料饮食(HCD)已成为威胁男性生殖健康的重要因素。全球范围内肥胖、糖尿病和非酒精性脂肪性肝炎等代谢性疾病的流行，正严重影响着哺乳动物的健康状况，其中生殖系统功能障碍尤为突出。令人担忧的是，代谢性疾病与男性不育在年轻人群中的正相关性日益显著，这些不良后果主要源于高精料饮食的过度摄入。多项研究表明，高精料饮食会对男性生殖功能产生负面影响，导致精子发生过程紊乱、精子形态异常和运动能力下降。

虽然生殖细胞是精子发生的核心，但近年来研究人员越来越关注支持细胞在这一过程中的重要作用。支持细胞的正常功能对精子发生至关重要，因为它们负责提供营养、维持细胞连接和支持生殖细胞的减数分裂。有研究表明，诊断为非梗阻性无精子症(NOA)的患者表现出显著的支持细胞功能损伤，这进一步强调了研究支持细胞损伤修复策略对维持男性生殖健康的重要性。

越来越多的证据表明，高脂饮食(HFD)引起的肠道菌群失衡会导致男性不育。通过高脂饮食小鼠的粪便微生物移植(FMT)实验证实，受体小鼠的精子质量下降，建立了肠道菌群与精子发生之间的因果关系。先前的研究发现，在代谢综合征模型中，维生素A代谢在"肠-睾丸轴"中起着关键作用，其异常最终会阻碍精子发生。肠道菌群能够自主分泌代谢物并调节宿主代谢物，研究表明高脂饮食会影响肠道菌群稳态和血浆脂多糖浓度，从而诱发代谢性内毒素血症，而内毒素血症是破坏睾丸结构、导致血睾屏障损伤的关键因素。

代谢物作为"肠-睾丸轴"中的重要中间物质，在生殖健康调节中发挥着重要作用。多项研究表明，补充精氨酸可促进精子发生的恢复，并挽救经白消安处理小鼠受损的精子质量。瓜氨酸作为精氨酸的前体和非必需氨基酸，在哺乳动物的小肠中合成，通过谷氨酸、谷氨酰胺和脯氨酸在肠细胞线粒体内合成。精氨酸通过参与一氧化氮的合成和释放在精子发生中发挥重要作用，因此研究L-瓜氨酸是否能作为"肠-睾丸轴"中的关键代谢物来增强支持细胞功能具有重要意义。

在这项发表于《npj Biofilms and Microbiomes》的研究中，研究人员通过建立高精料饮食绵羊模型，综合运用10x Genomics单细胞mRNA测序、16S rDNA测序和代谢组学分析等多项技术，系统探讨了高精料饮食对雄性生殖功能的影响及其机制。

研究采用的主要技术方法包括：建立高精料饮食动物模型（绵羊和小鼠）、单细胞转录组测序（10x Genomics平台）、16S rDNA扩增子测序、代谢组学分析（UPLC-MS系统）、粪便微生物移植、细胞培养实验（TM4支持细胞系和原代支持细胞）、组织学分析（H&E染色、免疫组化、免疫荧光）、分子生物学技术（Western blot、RT-qPCR、ELISA）以及统计学分析。

HCD contributes to DNA damage in Sertoli cells and impaired BTB structure

研究人员通过建立高精料饮食绵羊模型，发现HCD组睾丸形态异常，生精小管内生殖细胞部分脱落，支持细胞标志物SOX9表达显著降低。血睾屏障相关粘附基因Claudin11和Occludin的表达也明显减少。通过10x Genomics单细胞测序分析，发现HCD处理后支持细胞的发育轨迹发生显著改变，差异表达基因主要富集在生殖过程、DNA代谢、DNA生物合成等信号通路中，其中36.21%的基因参与DNA损伤和修复调节。Western blot检测显示HCD组睾丸中γH2AX表达更高，证实HCD诱导了支持细胞的严重DNA损伤。

Defective arginine biosynthesis, especially L-citrulline is related with DNA damage of Sertoli cells

代谢组学分析显示，HCD组和对照组的小肠内容物代谢物存在明显聚类差异，差异代谢物主要富集在精氨酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢通路，包括L-瓜氨酸、D-鸟氨酸、4-胍基丁酸和N-乙酰腐胺。其中L-瓜氨酸的变化最为显著，HCD组小肠内容物中L-瓜氨酸丰度显著降低。相关性分析显示，L-瓜氨酸水平与DNA损伤修复相关基因Pcna和Gtf2h5呈高度负相关，表明L-瓜氨酸代谢紊乱与HCD模型中支持细胞的DNA损伤过程密切相关。

HCD induces the disrupted homeostasis of the gut microbiota

16S rDNA分析显示，HCD组肠道菌群组成与对照组存在显著差异，在门水平上，厚壁菌门(Bacillota)和放线菌门(Actinomycetota)的相对丰度发生明显变化。在属水平上鉴定出36个发生改变的细菌，其中大多数属于厚壁菌门。Spearman相关性分析显示，Ruminococcaceae_NK4A214_group和Flexilinea与L-瓜氨酸代谢的四个代谢物显著相关，特别是Ruminococcaceae_NK4A214_group与L-瓜氨酸表现出显著相关性，并在线性判别分析中得分较高。功能预测分析表明，这些差异菌属显著参与L-瓜氨酸代谢。

Gut microbiota dysbiosis perturbs the integrity of BTB and induces apoptosis in Sertoli cells

通过粪便微生物移植实验，将对照组和HCD组绵羊的粪便上清液移植给小鼠，建立Con-FMT和HCD-FMT模型。HCD-FMT组小鼠睾丸出现生精小管形态异常和生殖细胞部分脱落，SOX9阳性细胞数量显著减少，血睾屏障相关基因Claudin11和Occludin表达明显降低。TUNEL染色显示HCD-FMT组TUNEL阳性细胞数量显著增加，表明肠道菌群失调会导致支持细胞DNA损伤和血睾屏障完整性破坏。

L-citrulline alleviates DNA damage in Sertoli cell line

细胞实验表明，蔗糖处理会导致支持细胞内活性氧(ROS)信号显著增加，而补充L-瓜氨酸能明显降低ROS水平。MTT实验显示L-瓜氨酸显著改善蔗糖处理的支持细胞增殖能力，Western blot检测发现L-瓜氨酸显著减轻支持细胞DNA损伤。与原代支持细胞实验一致，L-瓜氨酸能恢复DNA修复基因Pcna和Gtf2h5的正常表达，并上调血睾屏障相关基因Claudin11和Occludin，增强血睾屏障完整性。

The administration of L-citrulline ameliorates the impact of HCD-induced DNA damage in Sertoli cells and BTB integrity

体内挽救实验显示，补充L-瓜氨酸能显著提高HCD小鼠小肠内容物和睾丸中的L-瓜氨酸浓度，改善精子形态和数量，减少精子头部缺失、顶体异常和尾部卷曲等异常现象。H&E染色显示挽救组生精小管形态规整，免疫组化和Western blot证明SOX9阳性信号数量显著增强，ROS信号显著降低。血睾屏障相关基因Claudin11和Occludin表达明显改善，DNA损伤相关指标γH2AX、Pcna和Gtf2h5水平也得到恢复。

本研究通过多组学方法系统阐明了高精料饮食通过破坏肠道菌群稳态，影响L-瓜氨酸代谢，进而导致支持细胞DNA损伤和血睾屏障功能障碍的分子机制。研究发现Ruminococcaceae_NK4A214_group与L-瓜氨酸水平呈正相关，且补充L-瓜氨酸能有效挽救支持细胞DNA损伤，改善血睾屏障功能，提高精子质量。这些发现不仅推进了男性不育临床生物标志物的鉴定，还将膳食L-瓜氨酸补充定位为恢复生殖功能的可行策略。

研究表明，高精料饮食诱导的活性氧生成会导致氧化应激，高反应性活性氧分子会攻击细胞内的DNA结构，最终引起DNA氧化损伤。当检测到支持细胞DNA损伤时，细胞会启动DNA修复机制，PCNA位于复制叉处，促进DNA损伤修复和DNA损伤耐受的协调，而GTF2H5可刺激ERCC3/XPB ATP酶活性并在DNA开链过程中触发。如果DNA损伤不可修复，细胞将选择凋亡来消除自身，防止受损DNA的传递。本研究不仅发现Pcna和Gtf2h5表达急剧增加，还发现HCD和HCD-FMT组支持细胞内凋亡信号升高。相关性分析显示L-瓜氨酸与Pcna和Gtf2h5密切相关，表明L-瓜氨酸可能通过启动过度的DNA损伤修复机制来缓解支持细胞DNA损伤，最终改善精子数量和质量。

综上所述，这项研究阐明了L-瓜氨酸作为治疗长期高精料饮食所致男性不育的潜在靶点代谢物的作用机制，为通过"肠-睾丸轴"干预男性生殖功能障碍提供了新的理论依据和治疗策略。除了生殖益处外，L-瓜氨酸还具有广泛的光谱生理效应，包括内皮保护、减轻代谢性哮喘和促进肌肉骨骼耐力等，这些跨学科作用显著拓宽了其治疗范围，并为代谢性疾病的创新组合治疗方法提供了信息。