靶向GPR173(CCK3R)基因上调抑制慢性癫痫发作的新策略

《Translational Psychiatry》：Upregulation of CCK3R leading to the suppression of chronic seizures

本研究针对30-40%耐药性癫痫患者缺乏有效疗法的临床难题，通过AAV介导的GPR173(CCK3R)基因上调，发现其可通过增强CCK-GABA突触的抑制性长时程增强(iLTP)，有效恢复兴奋/抑制(E/I)平衡。在海人酸(KA)诱导的慢性癫痫小鼠模型中，CMV或CaMKII启动子驱动的GPR173过表达可长期抑制自发性癫痫发作，且未引起运动、焦虑和空间记忆等生理功能异常。该研究为耐药性癫痫提供了新型基因治疗靶点。

　　

在全球范围内，癫痫影响着约0.5-1%的人口，其中30-40%的患者对现有抗癫痫药物(AEDs)耐药，持续遭受癫痫发作的困扰。这种未满足的临床需求推动着新疗法的探索，包括基因治疗。传统药物直接靶向γ-氨基丁酸(GABA)受体虽能增强抑制，但因GABA受体在脑中广泛分布，常伴随不可避免的副作用。因此，寻找能更精确调控神经环路抑制性功能的新靶点，成为癫痫治疗研究的重要方向。

在此背景下，香港城市大学何凌、何菊芳团队在《Translational Psychiatry》上发表研究，探讨了G蛋白偶联受体173(GPR173)，也称为胆囊收缩素受体3(CCK₃R)，作为癫痫基因治疗新策略的潜力。研究人员前期工作发现，GPR173介导了胆囊收缩素(CCK)在GABA能中间神经元信号传递中的作用，并能诱导抑制性长时程增强(iLTP)，这是一种能持久增强抑制性突触强度的可塑性形式。基于此，他们提出假设：在慢性癫痫模型中上调GPR173的表达，可能通过增强抑制性张力，恢复大脑中失衡的兴奋/抑制(E/I)比例，从而抑制癫痫发作。

为了验证这一设想，研究团队首先通过海人酸(KA)海马注射建立了慢性癫痫小鼠模型，该模型在行为、生理和解剖缺损方面与人类慢性癫痫相似，会出现自发性反复发作。随后，他们构建了能穿透血脑屏障(BBB)的腺相关病毒血清型PHP.eB(AAV-PHP.eB)，分别搭载由巨细胞病毒(CMV)启动子或钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)启动子驱动的GPR173基因。

关键实验技术主要包括：1）利用海人酸(KA)海马注射构建慢性癫痫小鼠模型，并通过小鼠癫痫识别系统(MMRS)进行长期视频监控和癫痫行为分析；2）采用AAV-PHP.eB病毒载体通过横窦静脉注射或尾静脉注射进行全身性基因递送；3）运用免疫荧光染色和共聚焦显微镜观察病毒转染效率及GPR173表达定位；4）通过脑片膜片钳技术记录抑制性突触后电流(IPSC)和研究抑制性长时程增强(iLTP)；5）利用c-fos与CaMKII共标定技术评估癫痫发作期间神经元激活情况；6）通过旷场实验(OFT)、新物体识别测试(NORT)和莫里斯水迷宫测试(MWMT)等行为学方法评估基因治疗的潜在副作用。

GPR173上调增强皮层iLTP

研究人员在CCK-Cre小鼠的听觉皮层(ACx)注射病毒混合物，证实CMV-GPR173-eGFP能有效增加CCK-GABA末梢突触后神经元上的GPR173表达。

膜片钳记录显示，高频激光刺激(HFLS)CCK-GABA神经元后，GPR173上调组的抑制性突触后电流(IPSC)增强程度（即iLTP）显著高于对照组，而低频激光刺激(LFLS)则未诱发显著增强。这表明外源性增加GPR173表达有助于增强iLTP。

CMV启动子驱动GPR173过表达长期抑制慢性癫痫发作

在KA诱导的慢性癫痫小鼠模型中，单次静脉注射CMV-GPR173-eGFP病毒后，小鼠的癫痫发作频率在干预后短期内即显著下降，并在此后8周的观察期内维持在低水平。而注射对照病毒（CMV-Sham-eGFP）的小鼠发作频率无改善，甚至后期有所增加。组织学分析证实病毒成功跨越血脑屏障，并在转染的eGFP⁺细胞中高效表达GPR173。行为学初步分析未发现治疗对小鼠活动时间产生显著影响。

c-fos表达揭示KA诱导慢性癫痫后皮层兴奋性神经元过度活跃

对经历自发性癫痫发作的小鼠进行脑组织分析发现，其运动皮层(MCx)、视觉皮层(VCx)和听觉皮层(ACx)中有大量CaMKII⁺的兴奋性神经元共表达c-fos（神经元激活标志物），显著高于无癫痫发作的对照组。这表明皮层兴奋性神经元在慢性癫痫发作期间被广泛招募，呈现过度活跃状态，提示靶向这些神经元进行干预具有合理性。

CaMKII启动子驱动兴奋性神经元GPR173上调有效减少癫痫发作

为了更特异性地在兴奋性神经元中上调GPR173，研究人员使用了CaMKII启动子。尾静脉注射AAV-CaMKII-GPR173-mCherry后，与盐水对照组和假病毒对照组相比，GPR173过表达组小鼠的癫痫发作频率显著降低，尤其在观察后期，部分小鼠甚至连续多日无发作。免疫组化证实了病毒在兴奋性神经元（CaMKII⁺）中的高特异性和转染效率。

长期AAV介导的GPR173上调未诱发生理功能损伤或记忆丧失

为评估基因治疗的长期安全性，研究人员对正常小鼠进行病毒注射，并在12周后进行一系列行为学测试。旷场实验显示，GPR173上调未引发焦虑样行为，且该组小鼠在病毒表达12周后仍能维持与注射前相当的活跃水平，而对照组小鼠则因自然衰老出现活动水平下降。新物体识别测试和莫里斯水迷宫测试结果表明，GPR173上调未对小鼠的记忆功能（包括新物体识别记忆和空间记忆）产生负面影响。

AAV驱动GPR173长期表达未诱发转染兴奋性神经元异常放电特性

在病毒注射4个月后，通过膜片钳技术记录皮层兴奋性神经元的电生理特性。结果显示，GPR173上调神经元的动作电位数量、振幅、静息膜电位、动作电位半宽和首个动作电位潜伏期等指标，与对照组相比均无显著差异，表明长期的GPR173表达并未导致神经元兴奋性异常或神经毒性。然而，长期观察发现，GPR173过表达组小鼠的体重增长速度慢于对照组，提示GPR173可能影响食欲或代谢，这与CCK和GPR173已知的调节摄食和能量代谢的功能相符。生存率分析表明GPR173过表达不会导致致命性毒性。

本研究证实，通过系统性AAV基因治疗上调GPR173表达，能够有效增强CCK-GABA能突触的抑制性可塑性（iLTP），恢复癫痫大脑中的E/I平衡，从而长期抑制慢性癫痫发作。与直接靶向GABA受体的传统策略相比，靶向GPR173（CCK₃R）可能提供一种更精确、副作用更小的调控抑制性神经传递的新途径。该基因治疗策略在动物模型中展现出良好的有效性和安全性（除对体重增长的潜在影响外），为开发针对耐药性癫痫的新型疗法提供了强有力的临床前证据和极具前景的候选靶点。未来研究可探索GPR173特异性激动剂或其下游通路的药物开发，以及联合用药策略，以期进一步提升疗效。