在MAPT敲入原代神经元中诱导阿尔茨海默病相关tau病理可导致早期轴突病变和突触功能障碍

《Scientific Reports》：Seeding Alzheimer’s disease-associated tau pathology in MAPT knock-in primary neurons causes early axonopathy and synaptic dysfunction

本研究针对阿尔茨海默病(AD)中tau蛋白病理累积如何引发早期神经元功能障碍的机制问题，通过在MAPT敲入原代神经元模型中应用AD脑源性不溶性tau进行诱导，发现该模型可形成包含PAD暴露构象、寡聚体和磷酸化修饰的tau包涵体，主要定位于轴突，并伴随活性GSK3β共定位、突触蛋白积累、兴奋性突触丢失及NMDA受体依赖的网络超同步化，为研究AD早期病理事件提供了理想平台。

　　

在阿尔茨海默病的研究领域，tau蛋白的异常聚集一直被认为是导致神经元功能障碍的关键因素。随着研究的深入，科学家们发现病理性的tau蛋白具有类似朊病毒的"播种"特性，能够诱导正常的tau蛋白形成异常聚集体。然而，这些tau聚集体究竟如何引发早期神经元功能异常，特别是在轴突和突触水平的具体机制，仍然是未解之谜。

传统上，研究人员通常使用过度表达人类tau的转基因小鼠模型来研究tau病理。但这些模型存在明显局限性，比如tau蛋白的非生理性高水平表达，或者使用与家族性tau病相关的突变tau，这与占阿尔茨海默病绝大多数的散发性病例存在差异。更重要的是，小鼠大脑中天然只表达4重复(4R)tau异构体，而人类阿尔茨海默病患者脑中的神经原纤维缠结则同时包含3重复(3R)和4重复tau异构体。这种差异限制了传统小鼠模型在研究人类tau病理方面的转化价值。

为了克服这些局限性，密歇根州立大学的研究团队开发了一种新型的tau播种模型。他们利用MAPT敲入(MAPT-KI)小鼠，这种小鼠的整个鼠源Mapt基因被人类MAPT基因取代，成年后表达所有六种人类tau异构体，且水平处于生理范围。研究人员从这些小鼠中提取原代海马神经元，并用阿尔茨海默病患者脑组织来源的不溶性tau(AD-tau)进行处理，成功诱导了内源性人类tau的病理聚集。

研究的关键技术方法包括：使用MAPT-KI小鼠原代海马神经元培养模型，用AD患者脑组织(Braak V-VI期)来源的sarkosyl不溶性tau进行诱导；通过免疫细胞化学和共聚焦显微镜分析tau病理形态；采用高密度微电极阵列(MEA)记录神经元网络活动；利用邻近连接 assay(PLA)定量兴奋性突触密度；通过蛋白质免疫印迹和酶联免疫吸附 assay(sELISA)检测不同形式的tau蛋白。

原发性MAPT-KI培养物表征

研究人员首先详细描述了MAPT-KI原代神经元培养物中tau异构体的表达模式。通过蛋白质免疫印迹分析发现，在培养的早期阶段(DIV5)，神经元主要表达0N3R tau异构体。随着培养时间的延长(DIV14-31)，逐渐检测到0N4R、1N3R、1N4R和2N3R等多种异构体的表达，但主要的2N4R异构体在所有分析的时间点均未检测到。细胞类型分析显示，培养物主要由神经元(~66%)和星形胶质细胞(~33%)组成，少突胶质细胞比例很小(~1%)。

播种材料含有病理性tau种类

研究人员从晚期阿尔茨海默病(Braak V-VI期)患者额叶皮层组织中纯化了sarkosyl不溶性tau(AD-tau)，并以年龄匹配的认知正常个体(Braak I-II期)的样本作为对照。验证实验表明，AD-tau样本含有可检测的配对螺旋丝、在S396/S404位点磷酸化的tau(PHF1反应性)、3R和4R tau异构体、致病性PAD暴露构象(TNT1反应性)和tau寡聚体(TOC1反应性)。此外，使用HEK293 RD生物传感器细胞的实验证实了AD-tau样本具有播种能力，能在培养细胞中诱导荧光标记的MTBR蛋白形成明亮的包涵体。

用AD-tau处理MAPT-KI神经元导致PAD暴露tau包涵体的渐进形成

时间进程实验显示，用AD-tau处理MAPT-KI原代海马神经元可诱导PAD暴露tau构象的形成。免疫染色显示，AD-tau处理的神经元中PAD暴露tau包涵体随时间推移(DIV14-31)逐渐增加。从DIV14到22增加约5倍，从DIV22到31增加约2倍，从DIV14到31总体增加约12倍。对照处理的培养物也形成了少量PAD暴露tau包涵体，但在DIV31时，AD-tau培养物中的PAD暴露tau包涵体负荷比对照培养物高约16倍。通过省略透化步骤或使用胰蛋白酶处理去除细胞外蛋白的实验证实，这些包涵体确实位于细胞内部，是通过内源性tau的播种形成的。

PAD暴露tau包涵体主要存在于轴突中

通过共标记PAD暴露tau和细胞类型特异性标志物，研究人员确定PAD暴露tau包涵体主要定位在神经元的轴突(MAP2阴性/Tuj1阳性过程)中，树突体定位(MAP2阳性/Tuj1阳性过程)较为罕见。在GFAP阳性星形胶质细胞中未发现PAD暴露tau包涵体。

PAD暴露tau包涵体与AD相关寡聚tau种类共定位

在AD-tau处理的神经元中，PAD暴露tau(TNT1抗体)与寡聚tau(TOC1抗体)存在共定位。sELISA分析显示，PBS、对照和AD-tau培养物裂解液中的总tau水平相似，但AD-tau培养物裂解液中的PAD暴露tau和寡聚tau水平显著更高。

PAD暴露tau包涵体与AD相关磷酸化tau种类共定位

PAD暴露tau包涵体与AT8磷酸化tau和Ser422位点磷酸化tau(pS422抗体)高度共定位。与S396/S404位点磷酸化tau(PHF1抗体)的共定位水平较低。这些发现表明，用AD-tau处理MAPT-KI培养物会导致神经元中形成已知的早期病理性tau构象(即PAD暴露)和在多个疾病相关位点的tau磷酸化。

AD-tau处理神经元积累低水平中期tau种类，非成熟tau包涵体

研究人员评估了更成熟的病理标志物，如截短tau(caspase 3切割tau)和ThR结合(丝状tau)的存在。 caspase 3切割tau(TauC3抗体)标记的相对较少tau包涵体存在于处理的神经元中，主要定位在神经突，也有一些在受影响神经元的树突体室，通常不与PAD暴露tau共定位。ThR标记未在任何条件下发现丝状tau结构的证据。这些发现表明，大多数播种的病理存在于tau病理演变的早期阶段。

播种MAPT-KI培养物不会导致明显变性

研究发现病理性tau不会在MAPT-KI培养物中诱导明显毒性，通过CellTiter-Glo细胞活力 assay 或ApoTox-Glo assay 测量的细胞活力、细胞毒性或caspase-3/7活性均未显示处理效果。通过免疫印迹培养物裂解液测量神经元β-III微管蛋白和星形胶质细胞GFAP蛋白水平，或手动计数神经元、星形胶质细胞或少突胶质细胞数量，均未发现细胞类型特异性效应。

轴突变性评估显示，在处理之间，轴突物体数量/总轴突面积或平均轴突物体大小没有处理效果。钙蛋白酶活性测量作为轴突变性的间接指标，也未显示任何处理效果。最后，使用高密度MEA分析追踪单个处理神经元的动作电位传播，在总轴突长度、最长分支长度或平均动作电位传导速度方面未发现处理效果。这些结果表明tau播种不会导致明显的细胞死亡或轴突变性。

活性GSK3β与病理性tau包涵体共定位

研究发现活性GSK3β信号积累与一些pS422磷酸化tau包涵体共定位，表明在tau包涵体处存在GSK3β活性"热点"。轴突GSK3β活性可导致运动蛋白释放货物，这可能解释了在PAD暴露tau包涵体处突触蛋白和一些APP积累的原因。

货物蛋白与PAD暴露tau在神经突离散区域共积累

研究发现突触蛋白信号积累经常与对照和AD-tau神经元中具有PAD暴露tau的线状包涵体共定位。也观察到APP阳性神经突肿胀，对PAD暴露tau和β-III微管蛋白呈阳性，类似于在AD组织中观察到的轴突球状体。

AD-tau处理显著降低完整兴奋性突触密度

使用突触PLA量化完整兴奋性突触，发现与PBS对照组相比，用AD-tau处理显著降低了这些突触的数量约30%。

AD-tau处理导致MAPT-KI神经元网络超同步化

高密度MEA分析显示，在基线时以及顺序加入谷氨酸(Glu)和NMDA受体拮抗剂(AP5)后，测量培养物范围内的网络超同步化(即网络爆发)变化。在PBS培养物中，Glu引起神经元网络爆发频率比基线增加72%，但未达到统计学显著性。AP5处理后，网络爆发频率与Glu诱发的网络爆发频率相比显著降低。相比之下，在对照或AD-tau培养物中，加入Glu显著增加培养物网络爆发频率。用AP5处理显著降低网络爆发频率与Glu诱发水平相比。将网络爆发频率在PBS、对照和AD-tau培养物之间比较，在基线或Glu和AP5处理后未显示显著差异。为说明每组对Glu和AP5的相对反应，将数据绘制为每组平均基线的折叠变化。所有三组显示响应Glu从基线爆发频率增加(PBS=1.72倍; 对照=1.96倍; AD-tau=3.65倍)和响应AP5从基线爆发频率类似或减少(PBS=1.15倍; 对照=0.67倍; AD-tau=0.51倍)。值得注意的是，AD-tau培养物显示对Glu和AP5的反应最大，相对于PBS和对照培养物。

这项研究通过建立MAPT敲入原代神经元tau播种模型，揭示了阿尔茨海默病早期tau病理如何导致神经元功能障碍的具体机制。研究发现，AD脑源性tau播种可在表达生理水平人类tau异构体的神经元内诱导形成具有PAD暴露构象、寡聚化和特定磷酸化修饰的tau包涵体，这些病理变化主要位于轴突，与活性GSK3β共定位，并伴随突触蛋白积累、兴奋性突触丢失及NMDA受体依赖的网络超同步化。重要的是，这些病理变化在四周内并未进展为成熟丝状包涵体，也未导致明显神经元变性，成功模拟了阿尔茨海默病早期病理事件。

该模型的创新性在于使用MAPT-KI小鼠，避免了传统过度表达模型的局限性，同时表达了人类所有的tau异构体，更贴近散发性阿尔茨海默病的病理特征。研究发现tau包涵体主要定位于轴突，与轴突运输障碍标志物共定位，为理解tau病理如何通过影响轴突运输导致突触功能障碍提供了直接证据。此外，观察到的网络超同步化现象与阿尔茨海默病早期患者中观察到的神经元过度活跃相吻合，为理解疾病早期认知功能障碍的神经基础提供了重要线索。

这项研究的重要意义在于建立了一个能够模拟阿尔茨海默病早期tau病理的理想平台，该模型捕捉了从tau构象变化、轴突功能障碍到突触异常的关键病理事件，为研究tau介导的早期神经元功能障碍机制提供了有力工具。从治疗开发角度看，该模型可用于测试tau聚集、播散及早期毒性机制的抑制剂，为开发针对阿尔茨海默病早期病理过程的干预策略提供了新的可能性。