RSVTyper：基于纳米孔测序的全基因组呼吸道合胞病毒分型与自动分析平台的建立与应用

《Scientific Reports》：Whole-genome nanopore sequencing and automatic downstream analysis of respiratory syncytial virus using RSVTyper

本研究针对呼吸道合胞病毒（RSV）变异监测需求，开发了集成式全基因组扩增、测序与生物信息学分析流程RSVTyper。该方案通过多重PCR扩增与纳米孔测序，成功从临床样本和污水中获得高覆盖率基因组（>90%），并实现亚型与G基因重复序列的精准识别。研究证实RSVTyper适用于资源有限环境与高通量监测，为RSV疫苗逃逸突变追踪提供关键技术支撑。

　　

呼吸道合胞病毒（RSV）是全球范围内引起婴幼儿和老年人严重呼吸道感染的主要病原体，其高传染性和重复感染特性导致季节性爆发频繁。近年来，两种RSV疫苗获批上市，且多国推荐对所有新生儿使用长效单克隆抗体Nirsevimab进行被动免疫，这无疑会增加病毒的选择压力，使得对RSV变异的持续监测变得至关重要。然而，现有的RSV测序方案多基于短读长测序技术，或在处理低病毒载量、低质量RNA样本（如污水样本）时效率有限，且缺乏整合、自动化的生物信息学分析流程，难以在资源有限 settings 或需要高通量应用的场景下广泛部署。

为了解决这些问题，来自德国杜塞尔多夫大学医院等机构的研究团队在《Scientific Reports》上发表了他们的研究成果，开发了一套名为RSVTyper的集成化方法，该方法结合了实验室湿实验流程（全基因组扩增与纳米孔测序）和干实验流程（自动化的生物信息学分析），旨在实现对RSV的高效、低成本基因组监测。

为开展研究，研究人员主要应用了以下几项关键技术方法：1) 设计了针对RSV-A和RSV-B的泛亚型多重PCR引物组，产生39个约550 bp的重叠扩licon，适用于纳米孔测序；2) 使用牛津纳米孔技术（ONT）进行测序，样本来源包括2008年至2025年的243份RSV分离株（含临床样本和污水样本）；3) 开发了RSVTyper生物信息学流程（可通过Bioconda安装），该流程集成了自动参考序列选择（基于亚型和G基因重复检测）、使用ARTIC流程进行一致性序列生成以及通过Nextclade进行进化支分配。

设计用于高效扩增RSV的多重引物组

研究人员设计了一个包含126条引物的泛亚型扩增方案，成功对历史细胞培养分离株进行扩增和测序。结果显示，在病毒载量>10,000 copies/mL的样本中，98%获得了全基因组（>90%覆盖率），平均基因组深度达31,800x，F基因深度达41,400x，证明了引物组的高效性和稳健性。

开发用于生成RSV一致性序列的生物信息学流程

研究发现，使用错误的参考序列（如用RSV-B参考分析RSV-A样本）会导致读段映射效率显著下降和覆盖度缺口。此外，当样本与参考序列的G基因重复状态不匹配时，Medaka变异识别算法在54%的RSV-A和51%的RSV-B分离株中会错误地调用G基因序列。

为此，RSVTyper流程引入了三个关键步骤：1) 基于高变区读段计数的亚型自动检测；2) 通过分析G基因重复区域周围缺失模式来检测G基因重复状态；3) 从包含20个代表性序列的自建参考面板中最终选择最合适的参考序列。这一优化流程有效避免了嵌合序列生成和G基因错误调用。

2023年至2025年临床分离株的高效扩增与分型

对2023/24和2024/25赛季采集的148份临床样本（鼻咽拭子）的分析显示，RSVTyper在病毒载量>10,000 copies/mL的样本中，成功获得97%（118/122）的全基因组。F基因（疫苗和单抗主要靶点）的覆盖度在RSV-A和RSV-B中均达到85%。系统发育分析清晰显示了季节性进化支更替，2023/24赛季以A.D.1为主，2024/25赛季则转变为A.D.1.4为主，RSV-B均为B.D.4谱系。未检测到已知的Nirsevimab逃逸突变。

RSVTyper多重方法允许从污水中扩增和测序RSV

研究还成功将RSVTyper应用于污水样本的RSV监测。尽管PCR产量较低，但通过Freyja变异识别算法分析，在污水中检测到的RSV-A变异（主要是A.D.1）的频率与同期临床样本中的频率高度一致，证明了污水监测可用于无偏倚地筛查人群中的流行变异。

结论与讨论

本研究开发的RSVTyper提供了一个从湿实验到干实验的完整、低成本、可扩展的RSV测序解决方案。与杂交捕获或大片段扩增子方案相比，其小片段扩增子策略对低质量/低数量RNA样本更具鲁棒性，成功从低病毒载量样本和污水中获得基因组数据。自动化的生物信息学流程通过智能参考序列选择，有效解决了RSV高多样性导致的映射错误和G基因重复区域错误调用这一长期存在的难题（据估计，2022年后数据库中约4%的RSV序列因错误组装而缺失G基因重复）。该流程易于在资源有限环境中部署，有助于弥补中低收入国家RSV序列数据的巨大缺口。未来，随着RSV免疫策略的广泛实施，RSVTyper将极大促进对RSV变异，特别是疫苗和单抗靶向的F蛋白潜在逃逸突变的增强监测，为全球RSV防控提供关键技术支持。