光控抗体纯化新策略：Fc特异性单价蛋白G工程化消除抗体交联

《Scientific Reports》：Engineering of an Fc-specific monovalent protein G for the light-controlled affinity purification of antibodies

本文报道了一种创新的蛋白G工程化策略，通过定点突变（Asn478→Arg）消除其Fab结合活性，获得仅保留Fc高亲和力的单价变体Azo-ProtGN478R。该变体解决了传统多价蛋白G在溶液中引发抗体交联沉淀的难题，成功应用于光控亲和层析技术（Excitography），实现从高血清培养基中一步分离单克隆抗体（mAb），避免了酸性洗脱对抗体结构的损伤，为抗体药物纯化提供了温和高效的新工具。

　　

在生物医学研究和抗体药物制造中，单克隆抗体（mAb）的高效纯化是保证其功能与安全性的关键环节。目前，基于细菌免疫球蛋白结合蛋白（如蛋白A、蛋白G）的亲和层析技术虽广泛应用，却存在明显局限：酸性洗脱条件易导致抗体聚集和天冬酰胺（Asn）、谷氨酰胺（Gln）侧链脱酰胺化，损害抗体完整性。更棘手的是，天然蛋白G的单个Ig结合域（如C2结构域）具有双价结合特性——既能高亲和力结合IgG的Fc区域，又能以较低亲和力结合Fab区域。当蛋白G作为溶液中的适配体分子用于光控亲和纯化时，这种双价活性会引发抗体分子交联，形成不溶性免疫复合物，严重干扰纯化效率。

为解决这一难题，Peter Mayrhofer与Arne Skerra团队在《Scientific Reports》上发表研究，通过对蛋白G进行精准工程化，成功开发出一种仅特异性结合Fc的单价变体Azo-ProtG^N478R，彻底消除了抗体交联现象，并验证了其在光控纯化中的高效性与通用性。

研究中主要采用以下关键技术：基于晶体结构分析选定Asn478为关键突变位点；通过定点突变（N478R）与琥珀密码子抑制技术合成Azo标签化蛋白G变体；借助浊度测定、动态光散射（DLS）和表面等离子共振（SPR）评估突变体与抗体/Fab/Fc的互作特性；利用Excitography技术实现在生理缓冲条件下通过紫外A光（355 nm）触发洗脱的抗体纯化流程。

结果

蛋白G双价结合特性引发典型抗体沉淀反应

研究发现，野生型Azo-ProtG与不同治疗性抗体（如曲妥珠单抗、贝伐珠单抗、利妥昔单抗）混合时，在特定化学计量比下（尤其是1:4，mAb:ProtG）会形成大量沉淀，其浊度-浓度曲线符合经典的Heidelberger-Kendall沉淀反应规律：在抗体过量区沉淀较少，等价区沉淀最大，蛋白G过量区沉淀重新减少。该现象源于蛋白G可同时结合一个抗体的Fc和另一个抗体的Fab，形成交联网络。

Asn478→Arg突变有效消除Fab结合活性而不影响Fc亲和力

通过结构分析发现，蛋白G的Asn478位于其与Fab结合的界面，与Fab重链的Pro126、Val128形成氢键。将其突变为精氨酸（Arg）后，Azo-ProtG^N478R完全丧失Fab结合能力（SPR检测中Fab结合响应消失），而对Fc的亲和力仅略有下降（K_D从~500 nM变为~680 nM）。该突变体热稳定性甚至略有提升（T_m=79.8°C vs 78.7°C），且表达量与原版相当。

Azo-ProtG^N478R在光控纯化中展现优异性能

在模拟细胞培养上清（含10%胎牛血清的DMEM培养基）中，加入Azo-ProtG^N478R后未出现沉淀，而野生型蛋白G则引发显著浊度上升。通过Excitography技术，突变体成功从高背景蛋白中一步纯化出三种治疗性抗体，洗脱产物经SDS-PAGE验证纯度极高，且洗脱过程仅需紫外A光照射，无需低pH缓冲液，最大限度保持抗体天然构象。

讨论与结论

本研究首次通过单点突变（Asn478→Arg）实现了蛋白G从双价向单价结合特性的转化，解决了其在实际应用中引发抗体交联的核心问题。Azo-ProtG^N478R不仅保留了与Fc的高亲和力，而且完全消除了对Fab的结合活性，使其成为光控抗体纯化技术的理想适配体。该变体的成功开发拓展了Excitography技术在抗体研究中的应用前景，尤其为需要温和纯化条件的功能性抗体制备（如体内研究、细胞实验）提供了新方案。此外，该工程化策略也为其他多价结合蛋白的理性改造提供了重要参考，有望推动抗体纯化技术向更高效、更温和的方向发展。