靶向KRASG13C突变：环状连接链介导的核苷酸类共价抑制剂构效关系研究

《Scientific Reports》：Targeting KRASG13C with cyclic linker based inhibitors to explore warhead orientation

本研究针对KRASG13C突变致癌蛋白开发了一系列新型环状连接链核苷酸类抑制剂。通过质谱分析、动力学研究和蛋白质X射线晶体学验证了这些调节剂与Cys13的结合和反应性，并结合计算预测揭示了连接链构象空间与反应活性的关系。研究为优化核苷酸类KRAS抑制剂提供了重要的结构-反应性关系见解，推动了靶向KRAS突变癌症治疗的药物研发。

　　

在癌症研究领域，KRAS基因突变一直被视为"不可成药"的难题。这个被称为"癌症之王"的致癌基因在大约30%的人类肿瘤中发生突变，其编码的KRAS蛋白在细胞信号传导中扮演着关键角色。当KRAS发生致癌突变时，会导致蛋白从失活的GDP结合状态向激活的GTP结合状态失衡，从而放大增殖信号通路，促进肿瘤细胞的失控生长。

尽管KRAS长期被认为是药物开发的"噩梦"，但这一领域在近年来取得了重大突破。特别是针对KRAS^G12C突变的首批共价抑制剂sotorasib和adagrasib相继获得FDA批准，为非小细胞肺癌患者带来了新的希望。这些药物通过靶向突变产生的半胱氨酸残基，共价结合并抑制KRAS的活性。然而，除了G12C之外，KRAS还有其他重要的突变热点，其中密码子13的突变约占所有KRAS突变肿瘤的14%，而其中的6%为甘氨酸到半胱氨酸的替换（KRAS^G13C），这为开发新的共价抑制剂提供了潜在靶点。

研究团队在前期工作中已经证明了带有丙烯酰胺弹头的核苷酸类抑制剂靶向KRAS^G13C的潜力，但发现这些分子对目标Cys13的反应性相对较低，可能是由于脂肪族线性连接链的不利预取向造成的。基于此，研究人员设计并合成了一系列带有环状连接链的核苷酸类化合物，旨在探索弹头取向对Cys13反应性的影响。

研究方法主要包括化学合成、生物物理表征和计算模拟三个层面。化学合成方面，研究人员开发了新的合成策略，通过将GDP核苷酸用羰基二咪唑（CDI）保护，同时用丙烯酰氯修饰环状二胺连接链，然后将两个部分组装，最终去保护得到目标核苷酸类抑制剂。生物物理表征包括使用质谱分析研究共价修饰效率，通过SOS催化的核苷酸交换实验评估抑制剂活性，以及利用X射线晶体学解析抑制剂与KRAS^G13C的复合物结构。计算模拟方面，采用分子对接和微秒级分子动力学模拟预测连接链和弹头的构象空间。

化学和生物学实验

研究人员首先基于已发表的eda-GDP和bda-GDP与KRAS^G13C的共晶结构进行详细分析，发现两个分子的连接链区域都采用明显弯曲的构象以促进与Cys13的共价相互作用。基于这一发现，团队设计用环状连接链替代线性设计，以刚性化连接链，促进弹头的更好预取向，从而提高共价结合效率。

团队合成了八个带有环状连接链的化合物聚焦库。新的合成策略相比之前的方法有所改进，通过四步反应成功合成了目标分子。

KRAS^G13C的选择性共价修饰

质谱研究表明，所有化合物都能对KRAS^G13C 1-169（Cys-light）中的目标半胱氨酸13进行共价修饰，且反应性随pH值升高而增加，这与半胱氨酸亲核性增强有关。起始分子丙烯酸-eda-GDP 7a表现出与分子7b相似的反应性谱。此外，在六元环1,3位修饰的连接链（7b和7c）显示出最高的反应性，其次是五元和七元环（7d和7f），这表明弹头在1,3位的定位促进了优选取向，从而促进了共价反应。

相反，1,4位修饰的六元环（7h和7i）效果最差，可能是由于其高刚性和线性性质所致。此外，弹头携带位置的R构型略微更受青睐。时间分辨研究表明，化合物7b、7c和7d的修饰速率与母体分子7a相当，其中化合物7b的表现略优于7c和7d。

新型共价核苷酸类抑制剂的抑制效果

在SOS（Son of sevenless）催化的核苷酸交换实验中，研究人员观察到KRAS^G13C突变体与野生型KRAS相比具有更高的内在交换速率。用共价核苷酸类似物修饰蛋白质后，对于含有线性和环状连接链的化合物7a和7b，未观察到核苷酸交换，表明这些化合物将KRAS锁定在非活性状态，无法再被激活。

在另一个实验中，研究团队通过下拉实验评估了SOS催化的核苷酸交换是否在共价修饰后仍可能发生。实验使用GST标记的Raf RBD（RAS结合域），结果显示在添加GppNHp（带有和不带有SOS）的情况下，未修饰的KRAS^G13C能被下拉，证明GTP酶被激活并随后发生效应子结合。相反，用分子7a和7b共价修饰的KRAS^G13C在GppNHp和SOS存在下无法被激活，因此不与Raf RBD相互作用。

7b与KRAS^G13C突变体复合物的共晶结构

为了进一步表征带有环状连接链的新型核苷酸，研究人员将KRAS^G13C与化合物7b共结晶，获得了结合口袋内配体结合的详细结构信息（分辨率：1.85 ?，R 18.98，R_free：22.78）。

总体而言，获得的结构与先前发表的GDP结合（非活性）野生型结构高度相似，表明设计方法保留了核苷酸支架的结合几何结构，其保持相似取向并参与相同的重要可逆相互作用。与GDP核心相反，连接链暴露于溶剂中，不参与与蛋白质的额外相互作用。与先前发表的化合物7a相比，分子总体上也具有相似取向。然而，对于化合物7a，可以观察到核糖的2'-和3'-OH基团发生约1 ?的小位移，这可能是由连接链的高度 strained 和弯曲构象引起的，而化合物7b则没有这种情况。

有趣的是，在不对称单元中发现了三个RAS分子，其中靠近共价修饰的Cys13的连接链取向在这三个实例中建模不同，电子密度不如分子其余部分明确。这表明连接链具有灵活性，这与质谱研究结果一致，表明与化合物7a相比，连接链的 strained 程度较低。但也表明连接链的预组织仍需要通过进一步刚性化来优化，以促进有效的共价反应。

计算实验

为了更好地理解连接链的化学性质及其相关反应性，研究人员进行了连接链和弹头在核苷酸类抑制剂和KRAS^G13C内的构象空间的计算预测。采用的策略包括：使用DockThor对接引擎中的DockTScore生成丙烯酰胺含GDP类抑制剂7a-i与KRAS^G13C之间的可靠可逆复合物；使用微秒分子动力学模拟细化这些复合物，以探索天然条件下弹头与Cys13的接近程度。

GDP和Mg²⁺在模拟过程中的行为高度稳定，与文献中先前描述的核苷酸和Ras的高可逆亲和力一致。相比之下，GDP和弹头之间的连接链区域显示出更大的结构动力学。合成的化合物一旦与KRAS^G13C结合，其弹头大多采用远离Cys13的构象（距离>0.5 nm），而核苷酸（GDP）仍牢固插入核苷酸结合口袋中。值得注意的是，化合物7a、7b和7d的弹头构象比化合物7f和7i更频繁地靠近Cys13的硫原子，表明较高的观察反应性源于这种改进的预取向。然而，这些接近Cys13的构象状态（距离低于0.5 nm）的总占比在5.4%（7a）、6.2%（7b）、8.3%（7c）和14.1%（7d）到0.5%（7i）和0.2%（7f）的范围内，表明进一步的化合物优化仍然是必要且可能的，以进一步提高反应性。

结论与展望

本研究合成了一系列带有环状二胺连接链的共价结合核苷酸类似物聚焦库，系统研究了连接链刚性和几何形状如何影响与突变KRAS中Cys13残基的反应性。这些化合物通过抑制鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）催化的核苷酸交换和阻断效应子结合来破坏KRAS活性，有效将蛋白质稳定在其非活性状态。

虽然这些新类似物与母体分子相比未表现出增强的反应性，但通过X射线晶体学和计算机模拟进行的结构表征提供了新的见解，揭示了相当大的构象灵活性，解释了在生理pH下的低反应性。与先前发表的含有短线性乙二胺连接链的化合物7a相比，X射线晶体学数据表明化合物7b中的环状连接链构象 strained 程度较低，对核糖的影响减小，同时保持了对Cys13的相似反应性。

然而，为预测这些分子构象景观而开发的计算机模拟表明，只有少数类似物采用弹头靠近Cys13的构象以实现共价相互作用。因此，虽然在此阶段未能获得更具反应性的类似物，但这种方法可以解释观察到的在生理pH下的低反应性，并为指导未来具有优化预取向和反应性谱的核苷酸类抑制剂的设计提供了宝贵工具，为有针对性地增强这些化合物的反应性提供了系统框架。目前正在通过这种计算机模拟方法评估各种进一步的连接链 motif，有前景的含有环状和线性脂肪族连接链的分子将被相应合成和测试。

这项由Tonia Kirschner、Joao Rodriguez、Emerson Goncalves Moreira等研究人员完成的工作，为针对KRAS^G13C突变的药物开发提供了重要的分子见解，推动了靶向这一重要致癌靶点的治疗策略发展。研究成果发表在《Scientific Reports》期刊上，为克服KRAS靶向治疗中的挑战开辟了新途径。