铜胁迫下硫酸盐还原菌生物膜的长读长甲基化组学分析：表观遗传调控新机制

《Scientific Reports》：Long-read methylome analysis of Oleidesulfovibrio alaskensis G20 biofilm under copper stress

本研究针对硫酸盐还原菌(SRB)在重金属胁迫下表观遗传调控机制不清的问题，通过牛津纳米孔技术(ONT)首次揭示了Oleidesulfovibrio alaskensis G20生物膜在30μM铜(Cu)胁迫下的5-甲基胞嘧啶(5mC)甲基化图谱。研究发现TCCG为优势甲基化 motif，铜胁迫导致甲基化模式显著改变，关键通路基因(ABC转运蛋白、双组分系统等)呈现差异甲基化，为理解SRB表观遗传调控重金属应激反应提供了新视角。

　　

在工业环境中，硫酸盐还原菌(SRB)扮演着双重角色：既是导致金属材料生物腐蚀的"破坏者"，又是参与重金属生物修复的"清道夫"。这类微生物通过形成生物膜来抵抗重金属胁迫，但其背后的分子调控机制始终笼罩在神秘面纱中。铜作为广泛使用的抗菌剂，对SRB构成严重胁迫，而生物膜形成是SRB应对此类胁迫的关键策略。尽管前期研究发现Oleidesulfovibrio alaskensis G20(OA G20)在铜胁迫下会激活生物膜形成、应激反应基因表达等机制，但表观遗传调控特别是DNA甲基化在这一过程中的作用仍完全未知。

DNA甲基化作为重要的表观遗传修饰，在真核生物中的基因表达调控功能已被广泛研究，但在原核生物中，尤其是5-甲基胞嘧啶(5mC)的功能远未明确。细菌能否通过DNA甲基化这一" epigenetic开关"快速响应环境变化？这一问题在SRB研究领域尚属空白。为此，研究人员在《Scientific Reports》上发表了这项开创性研究，首次揭示了SRB生物膜在铜胁迫下的全基因组5mC甲基化图谱。

研究采用牛津纳米孔技术(ONT)长读长测序结合MicrobeMod分析流程，对0μM-Cu(对照)和30μM-Cu胁迫下的OA G20生物膜样本进行甲基化分析。技术核心包括：纳米孔测序文库制备(SQK-LSK109试剂盒)、修饰碱基识别(dorado碱基识别)、甲基化位点检测(MinION Mk1B设备)以及功能富集分析(GO和KEGG数据库)。

甲基化motif鉴定

研究发现在对照生物膜中，TCCG、CCCGCCCG和CGGGAT三个motif发生甲基化，其中TCCG为优势甲基化位点，在78,022个基因组位置中61.7%呈现5mC修饰。而在30μM-Cu胁迫下，仅检测到TCCG和GCAN^CTGCGS两个motif的甲基化，TCCG motif的63,315个位置中62.7%发生甲基化。值得注意的是，这些甲基化模式无法与已知的限制性修饰系统(R-M系统)关联，提示可能存在孤儿DNA甲基转移酶(DNMTs)的参与。

全局甲基化模式分析

比较分析发现，铜胁迫显著改变了全基因组甲基化格局。在甲基化水平超过75%的位点中，对照和30μM-Cu生物膜分别识别出341和424个基因组位置。特别值得注意的是，两种条件下共有的1,418个甲基化位点映射到的基因主要涉及转运、趋化性、运动性和群体感应等关键功能。

功能注释和通路富集分析

基因本体(GO)功能分析显示，共享甲基化基因显著富集于磷酸传递信号转导(GO:0000160)、转录调控(GO:0006355)和趋化性(GO:0006355)等生物过程，以及ATP结合(GO:0005524)、DNA结合(GO:0003677)和铁硫簇结合(GO:0005524)等分子功能。

KEGG通路富集分析进一步表明，差异甲基化基因主要参与微生物代谢、ABC转运蛋白、双组分系统、趋化性、硫代谢和鞭毛组装等关键通路。

碳代谢基因的甲基化

研究发现碳代谢和能量代谢相关基因存在差异甲基化模式。在30μM-Cu条件下，糖异生相关基因(Dde_1796、Dde_3597等)甲基化水平升高，而磷酸戊糖途径基因(Dde_3470、Dde_3502等)在对照样本中甲基化程度更高，表明OA G20可能通过调节碳代谢流向来应对铜胁迫。

应激响应通路的甲基化影响

氨基酸合成基因(特别是谷氨酰胺、半胱氨酸和甘氨酸合成途径)呈现差异甲基化模式，这些氨基酸是抗氧化剂谷胱甘肽合成的前体，提示甲基化可能通过调节氧化应激响应机制影响细菌的铜耐受性。

外排泵甲基化变化

ABC转运蛋白基因(包括钨、钼、钴/镍和锌转运系统)显示明显的甲基化变化。其中钼ABC转运蛋白modF(Dde_1055)在铜胁迫下甲基化水平显著升高(从0.6增至0.85)，表明DNA甲基化可能通过调控金属离子外排系统参与重金属解毒过程。

信号转导系统差异甲基化

双组分系统(TCS)相关基因呈现广泛甲基化。趋化性通路中，cheW(Dde_3100)和cheR(Dde_1198)等基因在铜胁迫下甲基化水平显著升高，表明甲基化在调节细菌趋化响应中发挥重要作用。鞭毛组装和运动性相关基因(fliN、flgH、motA/B等)以及群体感应相关基因(LuxR家族)也显示差异甲基化，提示表观遗传调控可能影响生物膜形成的早期阶段。

生物膜形成相关基因甲基化模式

脂多糖(LPS)合成基因(如CMP-KDO和HBP相关基因)和肽聚糖(PG)合成基因(如转肽酶/转糖基酶)均呈现差异甲基化。细胞分裂和形态相关基因(ftsX、mreB、mreC)的甲基化变化尤为显著，这与先前观察到的铜胁迫下OA G20细胞伸长现象相吻合。多糖合成和细胞粘附相关基因(包括多糖输出蛋白和c-二鸟苷酸环化酶编码基因)的甲基化模式变化，进一步表明DNA甲基化可能参与细胞外基质合成的调控。

本研究通过纳米孔长读长测序技术首次绘制了SRB在铜胁迫下的5mC甲基化图谱，揭示了环境压力如何重塑细菌表观基因组。研究发现不仅拓展了对原核生物表观遗传调控的认识，也为理解SRB在重金属胁迫下的适应性进化提供了新视角。尽管研究未能建立DNA甲基化与基因表达间的直接因果关系，但发现的差异甲基化模式为后续功能研究提供了重要靶点。这项研究建立的甲基化分析框架可应用于其他环境微生物体系，为开发基于表观遗传调控的生物腐蚀防治和重金属生物修复策略奠定了理论基础。