微管分支角度调控新机制：Augmin复合体通过双位点结合确立分支位点架构

《Nature Communications》：How augmin establishes the angle of the microtubule branch site

为解决微管分支成核过程中角度调控的分子机制问题，研究人员开展“Augmin复合体如何确立微管分支位点角度”的主题研究。通过冷冻电镜结构解析与生化功能验证，发现Augmin通过Haus6的CH结构域（微管结合区）和Haus8的无序N端MTBR协同调控微管结合亲和力与分支角度，揭示了分支微管极性维持的结构基础，对理解纺锤体组装至关重要。

　　

在真核细胞中，微管（Microtubules, MTs）作为细胞骨架的核心组成部分，不仅承担着细胞内物质运输和细胞运动的功能，更在细胞分裂过程中通过形成纺锤体来确保染色体的精确分离。而纺锤体中的大部分微管并非凭空产生，而是通过一种名为“分支微管成核”（branching MT nucleation）的途径，从已有的微管侧面以浅角度分支形成新的微管，从而保证母子微管具有相同的极性。在这一过程中，Augmin复合体作为关键分支因子，负责将γ-微管蛋白环复合物（γ-tubulin ring complex, γ-TuRC）招募到母微管上，并确立分支的角度。然而，Augmin如何结合微管并设定这一关键角度，长期以来一直是领域内未解的核心问题。

为解决这一难题，普林斯顿大学Sabine Petry团队在《Nature Communications》上发表了最新研究成果。研究团队通过冷冻电镜（cryo-EM）解析了Augmin亚复合体T-II_bonsai与微管结合的高分辨率结构，结合基于结构的生物化学分析和体外功能重建实验，揭示了Augmin通过其Haus6亚基的CH结构域（微管结合区）和Haus8亚基的无序N端（MTBR）这两个功能各异的结合位点，协同调控其与微管的结合亲和力，并精确设定分支角度的分子机制。这不仅深化了对微管分支成核机理的理解，也为探索纺锤体组装及相关疾病的病理机制提供了新的结构基础。

关键实验方法概述

本研究综合运用了多种关键技术：1） 冷冻电镜（cryo-EM）解析Augmin亚复合体T-II_bonsai与GMPCPP或GTPγS稳定的微管结合结构；2） 利用全内反射荧光（TIRF）显微镜进行微管结合实验，定量分析野生型与突变型Augmin（如缺失Haus8 MTBR或Haus6 CH结构域）的结合亲和力与微管晶格偏好性（GTPγS vs. GMPCPP）；3） 体外重建分支微管成核体系，使用重组Augmin、TPX2以及从非洲爪蟾（Xenopus laevis）卵提取物中纯化的内源性γ-TuRC，在MT种子模板上观察并统计分支微管的角度分布与动态；4） 微管捆绑实验评估Haus8 MTBR的微管交联功能。

研究结果

工程化Augmin T-II_bonsai用于结构研究

为解析Augmin与微管结合的结构，研究团队首先对全长Augmin复合体进行了截短优化。基于已有结构信息，他们在T-II四聚体的铰链区进行截断，获得了更小、更易处理且仍保持微管结合能力的亚复合体T-II_bonsai（包含Haus6, Haus7, Haus8的异源三聚体）。该复合体溶解度好，产量高，对微管的亲和力（K_D = 200 ± 80 nM）与全长复合体相当，是理想的结构研究靶点。

Augmin T-II_bonsai与微管结合的冷冻电镜结构

通过冷冻电镜单颗粒分析，研究团队获得了T-II_bonsai结合在14原纤维GMPCPP稳定微管上的3.8 ?分辨率重构结构，经对称扩展和局部优化后，单个微管二聚体结合单个T-II_bonsai的分辨率达到3.1 ?。

结构显示，仅T-II_bonsai的一部分（最靠近微管晶格的单个CH结构域和相邻的α螺旋茎区）呈现有序密度。通过刚性对接和序列比对，该CH结构域被确定为Haus6所有，其与单个αβ-微管蛋白二聚体形成约664 ?2的埋藏面积。令人意外的是，此前被认为是主要微管结合区的Haus8无序N端MTBR在图中未见明显密度，推测其因柔性而无法被观测。此外，Haus7的CH结构域虽在结构中存在，但并未直接接触微管晶格。

双位点结合界面在微管结合亲和力中的作用

为验证结构观察，研究团队通过TIRF显微镜分析了Augmin突变体的微管结合能力。结果显示，缺失Haus8 MTBR或Haus6 CH结构域均会显著降低Augmin与微管的结合，而缺失Haus7 CH结构域则无影响，证实Haus6 CH结构域是关键的微管结合位点，其作用甚至可能比经典的Haus8 MTBR更重要。进一步实验表明，Haus8 MTBR可能通过其带正电的特性与微管蛋白C末端尾巴发生静电相互作用，从而增强结合，这与NDC80复合体的结合模式相似。

分支因子的微管晶格偏好性

通过双色双核苷酸TIRF结合实验，研究发现Augmin与NDC80类似，强烈偏好结合模拟GTP状态的GTPγS晶格，而非模拟GDP-Pi过渡态或扩张的GMPCPP晶格。这种偏好性由Haus6 CH结构域主导，因为缺失Haus8 MTBR的Augmin仍保持此偏好。这解释了为何Augmin在体内倾向于结合较“老”的微管区域而非动态生长的正端。

体外分支重建揭示Augmin双位点调控分支角度

最关键的功能实验在于体外重建分支微管成核过程。仅使用Augmin、TPX2和γ-TuRC，即可在微管种子上成功重建出具有保守极性和浅角度的分支微管。

研究发现，野生型Augmin产生的分支角度主要集中在小角度范围（0-15°）。而缺失Haus8 MTBR或Haus6 CH结构域的Augmin突变体虽然仍能支持分支成核，但分支角度显著变宽（Haus8△MTBR均值约70°，Haus6△CH均值约41°），且角度分布更离散。这表明Augmin的两个结合位点均对确立分支角度至关重要：Haus6 CH结构域通过有序结合提供刚性定位，而Haus8 MTBR可能通过其微管捆绑能力（实验证实其能介导微管交联）将新生微管“拉近”母微管，从而稳定小角度分支。

结论与意义

本研究通过结构生物学、生物化学和细胞生物学等多学科技术手段，首次揭示了Augmin复合体通过其“双位点”微管结合模式（Haus6 CH结构域的有序结合和Haus8 MTBR的柔性结合）来协同调控微管结合亲和力与分支角度的精细分子机制。

该工作不仅解决了“柔性连接如何能定义刚性角度”这一长期存在的悖论，揭示了有序与无序相互作用在复杂生物过程中的协同功能，更重要的是，为完整理解纺锤体微管网络的生成、维持其结构极性以及相关细胞分裂异常疾病的机制提供了关键的分子蓝图。未来，确定γ-TuRC在Augmin复合体上的精确结合位点，将最终完成对微管分支位点结构的全景描绘。