核酸杂交激活酶催化：实现特异性识别与信号放大的协同耦合

《Nature Communications》：Activation of enzymatic catalysis via nucleic acid hybridization affords synergistic coupling of specificity, potency, and signal amplification

本文报道了一种通过核酸杂交编程调控酶催化活性的新方法。研究人员利用"硫醇开关"技术，将寡核苷酸通过二硫键与酶蛋白连接使其失活，当加入硫醇化互补链后，通过二硫键交换反应实现酶的特异性激活。该技术成功将高特异性的核酸杂交识别与高效的酶催化信号放大相结合，实现了纳摩尔级DNA序列特异性检测，并构建了布尔逻辑门，为生物技术和生物医学领域提供了新工具。

　　

在生物技术和生物医学领域，实现高特异性分子识别与高效信号放大的协同耦合一直是科研人员追求的目标。核酸杂交以其极高的特异性被誉为最特异的生物分子识别方式，而酶催化则是生物传感中最可靠的信号放大工具。然而，将这两种技术完美结合却面临重大挑战：现有的方法或限于使用活性酶，或需要复杂的蛋白质工程改造，难以实现规模化应用。

针对这一难题，丹麦奥胡斯大学Alexander N. Zelikin教授团队在《Nature Communications》上发表了一项创新性研究，开发了一种基于核酸杂交编程调控酶催化活性的通用平台。该技术通过"硫醇开关"机制，利用硫醇化寡核苷酸实现酶活性的精准控制：首先将蛋白质通过二硫键与寡核苷酸连接使其失活，形成酶原；当加入硫醇化互补链后，通过杂交介导的二硫键交换反应，释放酶蛋白并激活催化活性。

研究团队采用的关键技术方法包括：硫醇化寡核苷酸的Ellman试剂活化、蛋白质-核酸偶联物的制备与纯化、非还原性凝胶电泳表征、蛋白质质谱光度法分析、偶联酶活性检测体系（肌酸激酶-荧光素酶系统）、转录实验验证以及智能手机成像检测。

合成与表征DNA编码酶

研究人员首先合成了含有5'末端硫醇的20核苷酸DNA序列，通过二硫苏糖醇（DTT）或二硫丁胺（DTBA）去除保护基后，与Ellman试剂反应生成易于二硫键交换的DNA-ER复合物。高效液相色谱（HPLC）和质谱分析证实了成功合成。

选择肌酸激酶（CK）作为模型酶，该酶以82kDa同源二聚体形式存在，每个单体含四个可形成混合二硫键的硫醇基团，其中Cys-283位于活性位点。通过将DNA-ER与CK孵育，然后加入碘乙酰胺不可逆灭活未偶联的CK，成功制备了CK-DNA偶联物。非变性凝胶电泳显示每个蛋白亚基连接多个DNA链，蛋白质质谱光度法表明偶联导致CK二聚体解离为单体。

序列特异性与反应效力

通过偶联酶活性检测发现，只有加入硫醇化互补链（C）才能激活酶活性，而非互补链（NC）几乎无效果，证明了反应的序列特异性。即使将激活链从20个核苷酸缩短至12个，只要保持3'末端靠近蛋白质硫醇的序列完整性，仍能有效激活酶活性。

研究发现互补链浓度低至25nM时仍可检测到酶重新激活，且信号强度显著高于使用1μM非互补链。即使在血清存在条件下，该体系仍保持序列特异性激活能力，展示了其在复杂生物环境中的应用潜力。

酶活性条形码与逻辑门构建

研究进一步展示了该技术的正交性应用：分别对CK和T7 RNA聚合酶进行DNA编码，使其响应不同的核酸序列。当使用CK互补链时，该序列恰好是T7聚合酶的非互补链，反之亦然，实现了酶活性的特异性"条形码"识别。

研究人员成功构建了布尔逻辑门：OR门通过两个响应不同序列的CK-DNA偶联物实现，任一互补链均可激活激酶活性；AND门则需要同时激活CK和T7聚合酶才能完成ATP合成和RNA转录。这种正交激活能力为复杂生物分子计算和合成生物学应用奠定了基础。

生物传感应用

最具创新性的应用是开发了基于智能手机的DNA杂交检测平台。该体系包含阻断序列（B）、靶标序列（T）和激活链（A），只有当靶标T存在时，激活链A才能游离并重新激活报告偶联物C。

酶催化信号放大效果显著，使得使用普通智能手机摄像头即可在避光条件下检测到25nM的目标寡核苷酸。该方法在存在10倍浓度干扰DNA或克级基因组DNA背景下仍保持高特异性，为现场检测提供了强大工具。

本研究建立的核酸杂交激活酶催化技术，成功解决了特异性分子识别与信号放大的协同耦合难题。与传统方法相比，该技术无需蛋白质工程改造或复杂支架组装，易于规模化生产，适用于含硫醇基团的多种酶类。其在合成生物学、生物分子计算和现场诊断等领域的应用前景广阔，特别是为资源有限环境下的精准检测提供了创新解决方案。这种将最特异性识别事件（杂交）与最强大信号放大工具（催化）相结合的策略，为生物技术发展开辟了新途径。