PUS7介导7SK RNA假尿苷化调控RNA聚合酶II转录延伸的新机制及其在结直肠癌治疗中的意义

《Nature Communications》：Pseudouridylation of 7SK by PUS7 regulates Pol II transcription elongation

本研究针对假尿苷(Ψ)修饰是否调控转录这一前沿问题，系统揭示了假尿苷合酶PUS7通过介导7SK小核RNA(snRNA)的假尿苷化，稳定7SK-P-TEFb复合物，从而调控RNA聚合酶II(Pol II)启动子近端暂停释放和转录延伸的分子机制。研究人员发现PUS7缺失导致7SK Ψ250位点低假尿苷化，促进P-TEFb释放，增强Pol II CTD Ser2磷酸化，进而上调KLF6/DDIT3表达并诱导结直肠癌(CRC)细胞凋亡，显著增强5-FU化疗敏感性。该研究首次阐明Ψ修饰在转录调控中的直接作用，为CRC治疗提供了新靶点。

　　

在生命科学的精密调控网络中，RNA修饰正日益成为基因表达调控的关键层面。假尿苷(Ψ)作为最丰富的RNA修饰之一，已知在rRNA、tRNA、snRNA和mRNA等多种RNA物种中广泛存在，并参与pre-mRNA剪接和蛋白质翻译等过程。然而，一个长期悬而未解的科学问题是：这种重要的修饰是否以及如何参与转录调控过程？特别是在癌症发生发展中，Ψ修饰的异常是否通过影响转录进程驱动肿瘤进展？这些问题成为领域内亟待探索的前沿课题。

近日发表在《Nature Communications》的一项研究给出了突破性答案。由赵宇涛领衔的研究团队系统揭示了假尿苷合酶7(PUS7)通过介导7SK小核RNA的假尿苷化，精细调控RNA聚合酶II(Pol II)转录延伸的新机制，并阐明了该通路在结直肠癌(CRC)化疗敏感性调控中的关键作用。这项工作不仅拓展了对Ψ修饰功能的认识边界，也为癌症治疗提供了新的策略思路。

研究人员采用多种前沿技术方法开展系统性研究。他们利用癌症基因组图谱(TCGA)和基因型-组织表达(GTEx)数据库分析临床样本，通过细胞培养模型(包括HCT116、DLD-1、HT-29等CRC细胞系)进行功能验证，应用细胞分馏、蛋白质印迹、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)、硫酸氢盐诱导缺失测序(BID-seq)、光活化核糖核苷增强交联和免疫共沉淀(PAR-CLIP)、电泳迁移率变动分析(EMSA)、BIHIND-qPCR、甘油梯度沉降、KAS-seq、mRNA-seq、染色质免疫沉淀(ChIP)-qPCR以及dCas13b靶向系统等关键技术，全面解析了PUS7-Ψ-7SK信号轴的分子机制和功能意义。

PUS7调控CRC细胞核RNA假尿苷化

研究团队首先发现PUS7在结直肠癌组织中显著高表达，与不良预后密切相关。通过siRNA敲低PUS7，他们观察到CRC细胞增殖和干细胞自我更新能力明显受损。细胞分馏实验表明PUS7主要定位于细胞核但不与染色质结合。有趣的是，虽然PUS7已知是mRNA的Ψ合酶，但研究人员发现PUS7敲低对mRNA整体Ψ水平无显著影响，而在核RNA中则检测到Ψ水平的明显下降。

200 nt)Ψ水平变化。H BID-seq Ψ检测流程。I HCT116细胞核RNA假尿苷位点分布。J差异调控Ψ位点热图。K含UGUAG模体的8个差异调控Ψ位点热图。'>

应用BID-seq技术，研究团队在核RNA中鉴定出363个Ψ位点，并发现42个位点的Ψ水平在PUS7敲低后发生改变，其中25个位点显示Ψ水平下降。这些PUS7底物通常含有UGUAR(R=A或G)共识序列，包括丰富的snRNA 7SK、NEAT1和MALAT1。特别值得注意的是，7SK RNA仅含有一个UGUAG序列的Ψ位点(位于250位点)，该位点的Ψ分数从75%降至53%。

PUS7结合7SK RNA并调控其假尿苷化

通过PAR-CLIP实验，研究人员确认PUS7与185个靶标结合，其中富集于tRNA和snRNA家族。当将这些靶标与25个PUS7依赖性Ψ位点重叠时，7SK脱颖而出成为PUS7的新靶标。有趣的是，PUS7-PAR-CLIP读段覆盖显示PUS7优先结合7SK的3'末端，而非Ψ位点的确切位置，表明人PUS7识别并结合扩展的RNA序列。

体外实验进一步证实了PUS7与7SK的直接相互作用。催化实验显示PUS7对体外转录7SK的转换数约为0.3，电泳迁移率变动分析测得二者解离常数(K_d)为98±22 nM。通过BIHIND-qPCR检测，研究人员在多个细胞系中验证了PUS7敲低导致7SK Ψ250位点Ψ水平显著下降，表明7SK Ψ250是PUS7在不同癌症类型中保守的Ψ位点。

PUS7缺失促进P-TEFb组分从7SK释放

7SK是丰富的核非编码RNA，通过经典7SK核糖核蛋白(RNP)和屏障自整合因子(BAF)蛋白复合体调控转录。Ψ修饰有助于RNA折叠，而PUS7敲低导致的7SK Ψ250假尿苷化降低预期会促进更多P-TEFb复合体从7SK RNA释放。

为验证这一假设，研究人员使用抗LARP7、抗HEXIM1或抗MEPCE抗体免疫纯化7SK snRNP复合体，监测CDK9和细胞周期蛋白T1的共沉淀。结果显示，在PUS7敲低细胞中，与抗LARP7、抗HEXIM1或抗MEPCE共免疫沉淀的CDK9和细胞周期蛋白T1量显著减少。具体而言，细胞周期蛋白T1与LARP7、HEXIM1和MEPCE的相对结合在PUS7敲低细胞中分别降低67%、39%和71%。

同时，研究人员观察到hnRNP A1、Q和R与7SK(通过抗LARP7沉淀)的结合显著增加，这与P-TEFb从7SK释放后hnRNP与7SK结合的模型一致。通过免疫沉淀HEXIM1、CDK9或细胞周期蛋白T1并检测7SK RNA水平，发现尽管总7SK水平基本不变，但PUS7敲低后免疫沉淀的7SK水平较低。BIHIND-qPCR分析显示，与HEXIM1免疫沉淀的7SK中Ψ分数高于输入样本，而与CDK9免疫沉淀的则无此现象，表明HEXIM1可能优先与假尿苷化的7SK结合以锚定P-TEFb复合体。

甘油梯度分析进一步证实了PUS7敲低后，HEXIM1和CDK9从7SK结合组分(对应较大尺寸的7SK snRNP)向7SK游离组分(对应较小尺寸的7SK snRNP)转移，7SK也向与较小尺寸7SK snRNP相关的梯度移动，确认了PUS7敲低后P-TEFb从7SK RNP的增强释放。

PUS7缺失促进转录延伸

P-TEFb通过磷酸化Pol II CTD Ser2在转录调控中起关键作用。研究人员确实观察到PUS7缺失后Ser2磷酸化(S2P)水平增加，而Ser5磷酸化(S5P)未受影响。通过免疫荧光定量也独立证实了Ser2磷酸化的增加。

为研究转录延伸是否受影响，团队使用7SK反义寡核苷酸(7SK ASO)瞬时敲低7SK作为阳性对照，并应用酮氧辅助单链DNA测序(KAS-seq)监测PUS7敲低、7SK ASO和对照细胞中的转录过程。KAS-seq特异性捕获单链DNA(ssDNA)，揭示转录参与Pol II的动态，允许全基因组高灵敏度分析活性转录。

Metagene分析显示，PUS7敲低或7SK缺失导致Pol II在基因体区域积累，启动子区域周围减少。按KAS-seq信号排序的热图证实了PUS7敲低增强Pol II延伸。研究人员计算基因体与其启动子间Pol II占据比的"Pol II释放比"(PRR)，发现2058个检测到的活性基因中，PUS7敲低或7SK缺失后PRR显著增加，表明转录延伸增强。

选择三个代表性基因(EGR1、DDIT3和KLF6)进行深入分析，KAS-seq和Pol II-ChIP-qPCR均显示这些基因的Pol II占据和转录延伸增加。延伸增强也与mRNA水平基因表达上调相关。基因本体富集分析发现，PUS7敲低和7SK ASO组均显著富集凋亡通路和相关基因。

PUS7和7SK缺陷细胞共享部分重叠的转录组改变

主成分分析显示PUS7敲低和7SK ASO样本紧密聚集，两者均沿PC1(占方差50%)与对照样本远离。差异表达分析鉴定出PUS7敲低细胞中1,089个显著变化转录本(606个上调和483个下调)，7SK缺失细胞中769个显著变化转录本(440个上调和329个下调)。基因表达谱高度相关，表明PUS7和7SK缺陷细胞共享部分重叠的转录组改变。

基因集富集分析显示，与对照细胞相比，PUS7敲低和7SK ASO细胞中内源性凋亡信号通路显著上调。对胶质母细胞瘤干细胞PUS7敲低的公共数据重新分析也表明内质网应激介导凋亡显著上调，GBM干细胞和CRC细胞间差异表达基因存在显著重叠。

KLF6/DDIT3参与PUS7/Ψ/7SK下游通路

KAS-seq和mRNA-seq分析表明，PUS7缺失导致7SK低假尿苷化、增强Pol II转录延伸，并增加KLF6和DDIT3表达。作为肿瘤抑制因子，KLF6在结肠癌中频繁失活，低KLF6表达与较差总生存期相关。

研究人员假设通过PUS7缺失重新激活KLF6表达可能驱动ATF3/DDIT3介导的CRC细胞凋亡。实验证明，KLF6或DDIT3与PUS7共同敲低可挽救细胞活力，任一敲低也降低PUS7缺失引起的凋亡率，强调KLF6和DDIT3在介导PUS7缺失诱导凋亡效应中的关键作用。基因表达相关分析证实PUS7表达与KLF6表达间强负相关。

鉴于之前研究表明DDIT3表达增加使CRC细胞对5-FU敏感，而PUS7缺失通过PUS7/Ψ/7SK轴上调DDIT3表达，研究人员假设PUS7敲低可能类似增强CRC细胞对5-FU敏感性。实验表明，PUS7或7SK缺失后，两种细胞系对5-FU敏感性增加，剂量反应曲线左移。野生型PUS7过表达使CRC细胞对5-FU脱敏，而催化失活PUS7突变体(D294N)无此效应。

研究人员还应用小分子PUS7抑制剂NSC107512，在0.125μM浓度下使HCT116细胞活力降低约40%，模拟PUS7敲低效应，并显著增强5-FU敏感性，支持药理PUS7抑制作为增强CRC中5-FU疗效策略的可行性。

为确认7SK Ψ250假尿苷化是PUS7下游通路关键调控因子，团队利用催化失活RNA靶向CRISPR-Cas13系统特异性操纵7SK假尿苷化。通过将dCas13b系统与PUS7融合，测试这些拴结构建能否调控下游基因表达。拴系PUS7增加7SK Ψ250假尿苷化水平，降低Pol II Ser2磷酸化水平，下调KLF6和DDIT3表达水平，共同导致细胞增殖增强。此外，用dCas13b-PUS7靶向7SK假尿苷化显著赋予CRC细胞更强5-FU抗性。对照实验表明，dcas13b无PUS7连接时，之前观察到的效应不再出现。

研究结论与意义

本研究系统阐明了PUS7通过介导7SK RNA Ψ250位点假尿苷化，调控P-TEFb复合体稳定性，进而影响Pol II转录延伸的分子机制。研究发现PUS7缺失导致7SK低假尿苷化，促进P-TEFb从7SK snRNP解离，增强Pol II转录延伸，上调KLF6和DDIT3表达，诱导细胞凋亡并增强CRC细胞对5-FU化疗敏感性。

该研究的创新性在于首次揭示Ψ修饰在转录层面的调控功能，拓展了对RNA修饰作用范围的认识。研究不仅发现7SK是PUS7的关键下游底物，还阐明PUS7/Ψ/7SK信号轴在CRC化疗响应中的重要作用，为开发靶向该通路的新型抗癌策略提供理论依据。值得注意的是，7SK Ψ250的假尿苷化与m6A修饰在转录调控中呈现相反效应，提示不同RNA修饰间可能存在复杂的交互对话，未来在不同生物学环境中探索7SK上m6A和Ψ修饰间潜在交叉对话，对全面理解Pol II活性调控具有重要价值。

研究采用的dCas13b-PUS7靶向系统成功实现对7SK假尿苷化的精确调控，为RNA修饰的功能研究和潜在治疗应用提供了新技术平台。尽管研究存在PUS7敲低效率部分(-50%)可能低估其表型影响程度等局限，但整体工作为理解转录层面表观遗传调控开辟了新视角，具有重要的科学意义和临床转化潜力。