长读长RNA测序结合iso-LASER方法明确区分顺式和反式调控的选择性剪接事件

《Nature Communications》：Long-read RNA-seq demarcates cis- and trans-directed alternative RNA splicing

本研究针对遗传变异如何调控选择性剪接这一关键科学问题，开发了iso-LASER方法，结合长读长RNA测序技术，首次在单个样本水平实现了顺式（cis-directed）和反式（trans-directed）剪接事件的清晰划分。研究发现在人类和小鼠组织中存在数千个受遗传调控的顺式剪接事件，特别是在HLA基因和阿尔茨海默病相关基因（如MAPT、BIN1）中鉴定出新型顺式剪接事件，为理解疾病遗传基础提供了新视角。该成果发表于《Nature Communications》，为疾病机制研究和治疗靶点开发开辟了新途径。

　　

在真核细胞中，选择性剪接（Alternative Splicing）是增加转录组多样性的重要机制，对细胞分化、组织发育和疾病发生具有关键作用。剪接过程受到顺式作用元件（cis-regulatory elements）和反式作用因子（trans-acting factors，如RNA结合蛋白）的精密调控。遗传变异通过破坏剪接的顺式调控，成为连接基因型与表型的重要桥梁。然而，并非所有剪接事件都同样易受遗传变异的干扰，如何准确区分主要由顺式或反式机制主导的剪接事件，一直是领域内的难点。

传统的短读长测序技术难以准确解析等位基因特异性剪接（allele-specific splicing），特别是在高度多态性的基因区域如人类白细胞抗原（HLA）系统。随着长读长RNA测序（Long-read RNA-seq）技术的发展，科学家们现在能够获得全长转录本信息，这为在单样本水平研究等位基因特异性剪接提供了新的机遇。

在这项发表于《Nature Communications》的研究中，加州大学洛杉矶分校的Giovanni Quinones-Valdez、Kofi Amoah和Xinshu Xiao团队开发了名为iso-LASER的新方法，结合长读长RNA测序数据，成功实现了顺式（cis-directed）和反式（trans-directed）剪接事件的清晰划分。该方法通过从头变异检测（de novo variant calling）、基因水平分型（gene-level phasing）和等位基因连锁分析（allelic linkage analysis），首次在单个样本中就能识别出受遗传变异主导的顺式剪接事件和受反式因子主导的剪接事件。

研究人员主要利用了ENCODE计划产生的人类和小鼠长读长RNA测序数据，以及阿尔茨海默病患者和对照组的脑组织样本数据。关键技术方法包括：iso-LASER流程实现变异检测和单倍型分型；调整互信息（Adjusted Mutual Information, AMI）和百分比剪接指数差异（delta Percent-Spliced-In, ΔPSI）量化等位基因连锁；联合分析（isoLASER-joint）识别罕见变异；深度学习工具DeepRiPe预测RNA结合蛋白结合差异；以及AlphaFold2预测蛋白质结构影响。

长读长RNA测序揭示顺式和反式调控的剪接事件

研究团队首先在K562细胞中展示了长读长RNA测序的强大能力。以RIPK2基因为例，基于杂合SNP的基因型将长读长序列分为两个单倍型后，清晰识别出两类交替剪接事件：一类显示严格的等位基因特异性外显子包含模式（顺式调控），另一类在两个单倍型中显示相似的外显子包含水平（反式调控）。这种划分反映了在特定细胞环境中外显子调控的主导机制。

isoLASER方法检测长读长RNA-seq中的顺式和反式事件

研究人员开发的isoLASER方法包含三个核心步骤：从头变异检测采用基于de Bruijn图的局部重装配方法和多层感知机分类器，在HG002细胞数据中表现出优于GATK HaplotypeCaller、DeepVariant和Clair3的精度；基因水平分型采用加权k-means聚类方法，与HapCUT2和人类泛基因组研究联盟（HPRC）结果高度一致；剪接的等位基因连锁分析使用调整互信息（AMI）量化单倍型与外显子部分（exonic parts）的关联程度。

isoLASER分析人类和小鼠长读长RNA测序数据

应用isoLASER分析ENCODE数据发现，剪接谱的聚类主要按组织来源，而等位基因连锁谱的聚类则主要按供体身份，表明遗传背景在塑造个体剪接谱中的重要作用。在人类和小鼠组织样本中分别鉴定出2047和4679个独特的顺式调控外显子部分，其中约13%为GENCODE未注释的新外显子部分。来自同一供体的不同组织间顺式事件的共享度显著高于不同供体。

顺式剪接事件的遗传变异可能改变RBP结合

研究发现44个与顺式事件相关的剪接相关变异（SAVs）已知可改变RNA结合蛋白（RBP）的等位基因特异性结合（ASB）。 motif分析发现富含HNRNP（D/L/K）蛋白、KHSRP和SFPQ等剪接调控因子的结合位点。DeepRiPe预测显示，顺式事件变异显著改变RBP-RNA相互作用，支持其功能相关性。

isoLASER揭示HLA基因的等位基因特异性剪接并实现HLA分型

基因本体（GO）分析显示，含顺式事件的基因显著富集于免疫系统过程。在HLA基因家族中发现了广泛的等位基因特异性剪接事件，其中HLA-C基因的两个供体特异性顺式事件在不同组织中一致存在，且与特定HLA等位基因（C04、C06、C*03）相关。AlphaFold结构预测显示，这些事件导致MHC-I C末端结构域延长或跨膜螺旋大量缺失，可能影响蛋白功能。

阿尔茨海默病（AD）患者HLA基因的等位基因特异性剪接

在AD患者脑组织数据中，发现HLA-C和HLA-DMA等基因存在等位基因特异性剪接。通过isoLASER-joint分析，鉴定出位于MS4A6A、BIN1、HLA-DRA和HLA-DQA1等AD相关基因的SAVs，这些变异通过全基因组关联研究（GWAS）显著性阈值。差异等位基因特异性剪接分析发现，UBC基因中一个内含子保留事件在AD和对照组中呈现完全相反的等位基因连锁模式，可能导致 ubiquitin 结构域缺失，影响 Tau 和淀粉样蛋白聚集体的降解。

这项研究通过开发isoLASER方法，结合长读长RNA测序技术，成功实现了顺式和反式剪接事件的精确划分，为理解遗传变异对剪接调控的功能影响提供了新视角。方法学上的创新使得在单样本水平研究等位基因特异性剪接成为可能，特别适用于罕见变异分析和临床样本研究。在生物学意义上，研究发现剪接的遗传连锁谱具有高度个体特异性，且免疫相关基因特别是HLA系统富含顺式调控事件，为理解免疫多样性提供了新机制。在疾病应用方面，研究揭示了AD相关基因中新型顺式剪接事件，为疾病机制研究和治疗靶点开发开辟了新途径。该研究展示的方法和结论将推动未来对疾病遗传基础的研究，特别是在个性化医疗和精准治疗领域具有重要应用价值。