使用PDMS流动室进行脂肪组织移植培养：一种替代静态移植培养的方法

《Adipocyte》：Adipose tissue explant culture using PDMS flow chambers: an alternative to static explant culture

基于PDMS流 chambers的脂肪组织 explant体外培养方法研究。采用微流控技术构建含多孔隔膜的PDMS流 chamber，通过持续介质灌注和低剪切力环境维持脂肪组织三维结构及生理功能。实验证明，在含10% FBS的RPMI 1640培养基中，小鼠及人类脂肪组织 explants在72小时内保持>85%的存活率，且对β-受体激动剂异丙肾上腺素（10 μM）和胰岛素（100 nM）具有响应性，甘油释放量分别增加2.7倍和恢复至基线水平。显微成像显示流 chambers中脂肪细胞单脂滴结构完整度优于静态培养组，qPCR检测到PPARG和FABP4基因表达水平在优化培养基（M199+胰岛素+地塞米松）中维持更稳定。本系统有效解决了传统脂肪 explant培养中结构塌陷、炎症反应快和介质更换不便等难题，为代谢性疾病研究提供新型体外模型。

　　随着全球肥胖率的持续上升，研究脂肪组织在肥胖个体中的生理作用变得愈发重要。然而，脂肪组织的脆弱性和浮力特性使得其体外培养面临诸多挑战。传统的脂肪组织培养方法，如使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）流室，能够部分解决这些问题，但其在48小时内往往表现出细胞活性下降、炎症反应增加以及细胞去分化等现象。因此，研究人员开发了一种新的脂肪组织培养方法，旨在改善现有技术的局限性，使脂肪组织在体外环境中保持更长时间的活性和功能。这种方法不仅提升了培养的效率，还为后续的药物测试和细胞因子分析提供了更为便捷的条件。

在肥胖人群中，脂肪组织的功能紊乱是多种慢性疾病的重要诱因，如心血管疾病、糖尿病和癌症等。脂肪组织不仅仅是由脂肪细胞组成的，还包含多种其他细胞类型，如成纤维细胞、内皮细胞、前脂肪细胞以及免疫细胞。这些细胞共同构成了脂肪组织的复杂微环境，对局部和全身的炎症反应起着关键作用。因此，若要全面研究脂肪组织的功能，必须采用能够保留其结构和细胞网络的培养系统。然而，传统的脂肪细胞分化方法虽然在某些研究中被广泛应用，但其结果与体内脂肪组织存在显著差异。例如，体外培养的脂肪细胞往往含有多个脂滴（多泡型），而体内脂肪细胞则通常为单个脂滴（单泡型）。此外，体外模型缺乏脂肪组织的三维结构和SVF（血管周围细胞成分），难以真实反映脂肪组织的生理特性。

鉴于上述问题，研究团队开发了一种基于PDMS的流室系统，用于脂肪组织的体外培养。该系统通过减少空气界面，实现介质的持续灌注，并支持时间分辨的细胞因子检测和药物处理的便捷引入。这一创新设计在一定程度上克服了传统静态培养方法中由于脂肪组织浮力引起的细胞死亡、炎症反应以及结构破坏等问题。通过实验验证，使用PDMS流室培养的脂肪组织在72小时内保持了较高的细胞活性，且在生理功能、结构保持和基因表达方面表现良好。

为了评估细胞活性，研究人员采用了Resazurin和乳酸脱氢酶（LDH）检测方法。Resazurin是一种对细胞代谢活性敏感的染料，其还原程度可以反映细胞的生存状态。在实验中，新鲜采集的小鼠和人类脂肪组织样本在PDMS流室中培养72小时后，Resazurin的还原率仍维持在84%±9%左右，表明细胞活性良好。同时，LDH的释放量保持在较低水平，进一步证明了脂肪组织在流室中的稳定性。当加入0.2%的TX-100表面活性剂以加速细胞死亡时，LDH的释放量显著增加，这说明在流室中仍然存在大量活细胞。此外，通过加入异丙肾上腺素（isoproterenol）和胰岛素，研究人员观察到了脂肪组织脂解作用的变化。异丙肾上腺素能够显著增加甘油释放，而胰岛素则能够抑制这种释放，进一步验证了脂肪组织在体外环境中对已知调节因子的响应能力。

在评估脂肪组织结构保持方面，研究人员利用共聚焦显微镜对培养后的脂肪组织进行了成像分析。结果表明，PDMS流室能够更好地维持脂肪组织的三维结构和细胞网络。与传统静态培养相比，流室培养的脂肪组织在共聚焦成像中表现出更稳定的PLIN1（ perilipin 1）染色，这标志着脂肪细胞中脂滴的完整性。相比之下，静态培养的脂肪组织则显示出明显的结构破坏，表明流室系统在维持脂肪组织结构方面具有显著优势。CD45染色进一步证实了免疫细胞在流室中的保留，这为研究脂肪组织的免疫调节功能提供了重要依据。

在基因表达方面，研究人员通过实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）分析了脂肪组织标志基因的表达情况。实验结果显示，使用优化后的培养基（M199，含7 nM胰岛素和25 nM地塞米松）能够显著提高脂肪组织中PPARG和FABP4等关键基因的表达水平，而ADIPOQ的表达则仍有所下降。这一现象可能与地塞米松对ADIPOQ表达的抑制作用有关。此外，流室系统在维持脂肪组织基因表达方面优于传统静态培养方法，这为研究脂肪组织在体外环境中的基因调控提供了新的思路。

在实验设计中，研究人员还考虑了多种技术细节，如培养基的选择、流室的组装和实验参数的优化。为了确保实验的准确性，他们采用了多种培养基，包括RPMI 1640（含10%胎牛血清）和M199（含胰岛素和地塞米松）。RPMI 1640虽然适用于一般性的细胞活性检测，但M199在维持脂肪组织基因表达方面表现更优。此外，PDMS材料的使用在某些情况下可能会影响小分子物质的传递，因此在实验设计中需要特别注意这一因素，确保所用药物和试剂能够有效传递至脂肪组织。

研究团队还指出，当前实验数据的样本量相对有限，未来仍需进一步扩大样本数量以验证该系统的广泛适用性。同时，实验参数的优化，如脂肪组织的大小和流速的控制，也将是未来研究的重要方向。PDMS流室的设计具有高度的可扩展性和模块化特点，未来有望应用于其他类型的原代组织研究。该系统的简便性和可重复性，使其成为一种具有潜力的体外研究工具。

在讨论部分，研究团队对比了当前多种脂肪组织体外研究方法的优缺点。例如，微流控芯片系统虽然能够培养成熟的单泡型脂肪细胞，但缺乏SVF成分，无法全面反映脂肪组织的复杂性。而脂肪球体模型则能够更真实地模拟脂肪组织的三维结构，但其仍然无法完全再现体内环境。相比之下，PDMS流室系统不仅能够维持脂肪组织的结构完整性，还能实现介质的持续灌注，从而减少频繁更换介质的需要，提高实验的连续性和可操作性。

此外，研究团队还提到，该系统的应用需要考虑伦理和合规性问题。在人类样本的收集过程中，研究团队严格遵守了《赫尔辛基宣言》的相关规定，并通过了UCLA机构审查委员会的审批。对于动物实验，研究团队同样遵循了动物研究的伦理规范，确保实验过程符合科学和伦理标准。这一系列的伦理措施为研究提供了合法性和可靠性保障。

综上所述，PDMS流室系统为脂肪组织的体外研究提供了一种新的方法。该系统在维持脂肪组织活性、结构和基因表达方面表现出显著优势，为研究肥胖相关疾病的病理机制提供了更为真实的模型。尽管当前研究仍处于初步阶段，但其设计思路和实验结果为未来更深入的脂肪组织研究奠定了基础。通过不断优化实验参数和扩大样本规模，该系统有望成为一种广泛应用于基础研究和临床转化研究的工具。