针对多重耐药病原体的高效抗菌活性，基于特定菌株的枯草芽孢杆菌衍生的银纳米颗粒：体外模型

《International Journal of Nanomedicine》：Strain-Specific Bacillus subtilis-Derived Silver Nanoparticles for Effective Antibacterial Activity Against Multidrug-Resistant Pathogens: In Vitro Model

本研究比较了B. subtilis 168与3610菌株在生物合成AgNPs和AuNPs中的效率及抗菌活性。结果表明，野生型菌株3610合成AgNPs更快且更高效，其AgNPs在2 μg/mL下即可抑制多重耐药菌生长，而168菌株需16 μg/mL。结构分析显示3610的AgNPs粒径更均一，表面稳定剂更少，抗菌机制涉及膜破坏和银离子释放

　　纳米颗粒，特别是银纳米颗粒（AgNPs）和金纳米颗粒（AuNPs），已经成为提升药物稳定性、生物利用度以及实现靶向递送的有力工具。随着全球对纳米颗粒需求的不断增长，可持续且生物相容性的生产方法显得尤为重要。本研究通过两种基因上密切相关的大肠杆菌菌株——*Bacillus subtilis* 168和*Bacillus subtilis* 3610，探讨了银纳米颗粒和金纳米颗粒的生物合成效率及其抗菌潜力。通过对比不同菌株生成纳米颗粒的性能，我们进一步理解了菌株特性如何影响纳米颗粒的生成、稳定性和抗菌效果。

### 纳米颗粒的生物合成与抗菌潜力

纳米颗粒因其在物理、化学和生物学领域的独特性质，成为科学和技术革新中的重要组成部分。纳米颗粒的尺寸和形状对其物理化学特性具有决定性影响，这些特性决定了它们在生物医学中的应用潜力。例如，银纳米颗粒和金纳米颗粒因其表面等离子体共振（SPR）效应而表现出独特的光学特性，这使得它们在医学成像、诊断和治疗方面具有广泛应用前景。银纳米颗粒的抗菌机制包括破坏细菌膜、产生活性氧（ROS）以及释放银离子（Ag?），这些特性使得它们在对抗多重耐药菌株方面表现出色。相比之下，金纳米颗粒因其SPR特性，在医学成像和靶向药物输送中具有独特优势，特别是在利用其高对比度增强诊断精度和治疗靶向性方面。

研究中，我们采用了两种不同的生物合成方法：银纳米颗粒通过细菌细胞培养液的胞外合成，而金纳米颗粒则通过将洗涤后的细胞团与金盐孵育实现胞内合成。这种合成方法不仅避免了化学合成中可能产生的有毒副产物，还使得纳米颗粒具有更高的生物相容性和环境友好性。为了全面评估这些纳米颗粒的性质，我们采用了多种分析技术，包括紫外-可见光谱（UV-Vis）、单颗粒电感耦合等离子体质谱（sp-ICP-MS）、热重分析（TGA）、扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）以及原子力显微镜（AFM）等。

研究结果表明，*Bacillus subtilis* 3610菌株在纳米颗粒的合成效率和抗菌效果上均优于实验室驯化的*Bacillus subtilis* 168菌株。*Bacillus subtilis* 3610在2天内即可完成银纳米颗粒的合成，而*Bacillus subtilis* 168则需要3天。此外，*Bacillus subtilis* 3610合成的银纳米颗粒显示出更优异的抗菌活性，其对*Pseudomonas aeruginosa*的最小杀菌浓度（MBC）为2 μg/mL，而对*Escherichia coli*的MBC则为8 μg/mL。相比之下，*Bacillus subtilis* 168合成的银纳米颗粒的MBC分别为16 μg/mL和32 μg/mL，这表明3610菌株生成的纳米颗粒具有更高的抗菌效能。这种差异可能源于菌株之间在基因表达、代谢活动和细胞表面特性上的不同，例如3610菌株可能具有更强的酶活性或更丰富的生物分子参与纳米颗粒的合成和稳定。

金纳米颗粒的合成则表现出不同的特点。虽然两种菌株都能生成金纳米颗粒，但3610菌株合成的金纳米颗粒呈现出更均匀的分布，并且与细胞膜紧密结合。而168菌株生成的金纳米颗粒则呈现出较广的尺寸分布，且表面可能附着更多的杂质。这种差异可能与菌株的表面蛋白组成和细胞膜结构有关，表明不同菌株的生理和代谢特性在纳米颗粒的合成过程中起到了关键作用。

### 合成条件的优化

为了提高纳米颗粒的合成效率和性能，我们对合成条件进行了系统优化，包括温度、时间以及金属盐浓度。对于银纳米颗粒，3610菌株在37°C下表现出更快的合成速度，且在48小时内即可达到最佳产量。相比之下，168菌株需要更长的孵育时间才能实现类似效果。这可能与菌株的代谢速率和细胞外蛋白的活性有关。此外，3610菌株对银盐的浓度要求略高于168菌株，这可能意味着其对银离子的摄取和转化能力更强。

对于金纳米颗粒，两种菌株的合成对温度的响应略有不同。168菌株在37°C下表现最佳，而3610菌株则在30°C下达到最佳效果。这表明不同的菌株可能依赖于不同的酶系统或代谢途径来实现金离子的还原和纳米颗粒的形成。时间优化实验显示，两种菌株在48小时内都能达到较高的纳米颗粒产量，而金盐的浓度优化则表明，两种菌株在7 μL浓度下均表现出最佳的合成效果。这种差异进一步表明，纳米颗粒的合成过程受到菌株内部酶活性、细胞膜结构以及外界环境因素的共同影响。

### 纳米颗粒的稳定性与形态分析

纳米颗粒的稳定性是其在实际应用中至关重要的因素。我们通过热重分析（TGA）和UV-Vis光谱对纳米颗粒的稳定性进行了系统评估。结果显示，两种菌株生成的纳米颗粒在20–700°C范围内均表现出相似的热稳定性，但在更高温度下，3610菌株生成的纳米颗粒表现出更优的耐受性。此外，我们还观察到，3610菌株生成的银纳米颗粒在不同培养基中均能保持更稳定的尺寸分布，而168菌株生成的纳米颗粒则在长时间培养后出现尺寸分布变宽和颗粒数量减少的现象。这表明3610菌株生成的纳米颗粒具有更高的稳定性和一致性。

形态学分析显示，3610菌株生成的银纳米颗粒呈现出更均匀的球形结构，而168菌株生成的纳米颗粒则表现出更大的尺寸分布和更高的聚集倾向。这种差异可能与菌株的胞外蛋白组成有关，其中3610菌株的表面蛋白可能更有效地稳定纳米颗粒，防止其聚集。此外，金纳米颗粒的形态分析表明，3610菌株生成的金纳米颗粒在表面分布上更为均匀，且与细胞膜结合更为紧密，这可能与其表面蛋白的特异性有关。

### 表面化学特性分析

为了进一步理解纳米颗粒的表面化学特性，我们采用了FTIR和MALDI-TOF等技术。FTIR分析显示，两种菌株生成的纳米颗粒均表现出与生物分子相关的吸收峰，这些吸收峰可能对应于蛋白质、多糖或磷脂等分子的参与。其中，3610菌株生成的银纳米颗粒表现出更简单的吸收峰，而168菌株生成的纳米颗粒则表现出更复杂的吸收峰，这可能意味着3610菌株生成的纳米颗粒表面覆盖的生物分子种类较少，但更为均匀。

MALDI-TOF分析进一步支持了这一结论，显示3610菌株生成的银纳米颗粒表面具有更明确的生物分子信号，而168菌株生成的纳米颗粒则表现出较弱的信号，这可能与其表面覆盖的分子种类和数量有关。这些结果表明，纳米颗粒的表面化学特性与其生物相容性、稳定性和抗菌效果密切相关，且不同菌株之间的差异可能影响纳米颗粒的表面覆盖情况。

### 抗菌活性的评估

为了评估银纳米颗粒的抗菌活性，我们采用了多种方法，包括平板计数法（plate count assay）、活/死荧光染色（live/dead fluorescence staining）和SEM分析。这些方法共同揭示了纳米颗粒对细菌细胞的破坏作用，包括细胞膜破裂、细胞结构变形以及细胞内银离子的积累。通过这些分析，我们发现3610菌株生成的银纳米颗粒在更低的浓度下即可实现对多重耐药菌株的高效抑制。

例如，3610菌株生成的银纳米颗粒在2 μg/mL浓度下即可对*P. aeruginosa*实现完全的杀菌效果，而168菌株生成的纳米颗粒则需要16 μg/mL。同样，对于*E. coli*，3610菌株生成的纳米颗粒在8 μg/mL浓度下即可实现杀菌，而168菌株则需要32 μg/mL。这种浓度差异表明，3610菌株生成的纳米颗粒具有更高的抗菌活性，这可能与其更小的尺寸、更均匀的形态以及更薄的表面覆盖有关。

此外，我们还发现，3610菌株生成的纳米颗粒在较低浓度下即可实现对细菌的破坏，而168菌株生成的纳米颗粒则需要更高的浓度。这可能与纳米颗粒的表面覆盖特性有关，3610菌株生成的纳米颗粒表面覆盖的分子种类较少，可能更有利于其与细菌膜的直接相互作用，从而增强其抗菌效果。同时，我们还观察到，纳米颗粒在细菌细胞内的积累和分布，进一步支持了其通过银离子释放和膜破坏机制实现抗菌作用的假设。

### 结论与意义

本研究揭示了两种密切相关菌株在纳米颗粒生物合成过程中的显著差异。*Bacillus subtilis* 3610菌株因其保留的野生型特性，如表面活性物质（如surfactin）的生成、更强的代谢能力和更广泛的酶系统，表现出更高的纳米颗粒合成效率和更优异的抗菌性能。相比之下，*Bacillus subtilis* 168菌株由于实验室驯化过程中基因的改变，可能在某些代谢途径和表面蛋白表达方面有所下降，导致其生成的纳米颗粒在稳定性和抗菌效果上不如3610菌株。

这些发现强调了菌株选择在微生物纳米材料合成中的重要性，并表明3610菌株生成的银纳米颗粒具有作为生物医学应用候选材料的巨大潜力。未来的研究可以进一步探索这些菌株在纳米颗粒合成过程中的具体分子机制，以及如何通过基因工程手段优化纳米颗粒的性能，以满足实际应用中的需求。此外，研究结果也为绿色纳米颗粒合成技术的发展提供了新的思路，尤其是在应对多重耐药菌株和开发高效抗菌材料方面。