设计多功能纳米酶以重新调节慢性伤口中的氧化应激和炎症反应

《International Journal of Nanomedicine》：Engineering Multifunctional Nanozymes to Reprogram Oxidative Stress and Inflammation in Chronic Wounds

糖尿病溃疡存在炎症失调和氧化应激过盛问题，本研究开发Ru@ACEI纳米系统，结合 ruthenium的抗氧化活性与ACEI的抗炎作用，通过抑制NLRP3/caspase-3/9凋亡通路，降低IL-1β和CRP水平，促进内皮细胞增殖和胶原沉积，实验显示其加速伤口愈合并改善系统性炎症，为糖尿病溃疡治疗提供新策略。

　　糖尿病伤口是全球范围内日益严重的临床问题，其特点在于持续的免疫失调和过度炎症反应，这会显著影响伤口的愈合能力并导致慢性进展。传统的治疗方法包括清创、抗菌敷料、负压伤口治疗以及生长因子的应用，尽管这些方法在一定程度上能够改善伤口愈合，但它们往往难以全面解决糖尿病伤口背后的病理微环境问题，如持续性炎症、过量氧化应激和内皮功能障碍。因此，迫切需要更加精准且多功能的治疗策略来调控糖尿病伤口的病理微环境。

为了应对这一挑战，研究团队开发了一种复合纳米系统Ru@ACEI，该系统由负载有血管紧张素转换酶抑制剂（ACEIs）的钌（Ru）掺杂的中空介孔二氧化硅纳米颗粒组成。Ru@ACEI纳米颗粒具有双重酶模拟活性，包括超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性，能够有效清除过量的活性氧（ROS）。这一特性不仅有助于降低细胞凋亡，还能促进内皮细胞的增殖。在细胞内吞后，Ru@ACEI可以催化过氧化物分解为水和氧气，从而抑制NLRP3/Caspase-3/Caspase-9凋亡通路。这种作用改善了内皮细胞的存活率，有助于逆转糖尿病伤口中的局部过度炎症状态。

Ru@ACEI纳米颗粒的合成过程涉及多个步骤。首先，通过乳液聚合方法制备了单分散的聚苯乙烯（PS）微球作为牺牲模板。随后，将这些模板与10 mM的RuCl?·xH?O溶液在600 rpm的搅拌条件下孵育12小时，以吸附Ru3?离子。Ru负载的PS颗粒经过离心收集并用去离子水洗涤三次后，采用改进的St?ber方法在模板表面形成介孔二氧化硅壳层。最终，通过高温煅烧去除PS核心和CTAB模板，得到负载有Ru纳米颗粒的中空介孔二氧化硅纳米颗粒（Ru-MSN）。随后，通过APTES在乙醇中进行功能化处理，引入氨基基团。ACEI成分则采用薄膜水合法制备脂质体，其中使用了HSPC、胆固醇和enalapril maleate作为主要成分。最终，通过将Ru-MSN与ACEI脂质体结合，形成了Ru@ACEI纳米颗粒。

在表征方面，Ru@ACEI的形态和微观结构通过透射电子显微镜（TEM）和高分辨率TEM（HR-TEM）结合能谱（EDS）成像进行了详细分析。结果表明，Ru纳米颗粒成功地被包裹在ACEI脂质体中，并且整体结构保持均匀。紫外-可见吸收光谱显示，Ru@ACEI在257 nm处具有与ACEI相似的特征吸收峰，这进一步验证了Ru纳米颗粒的包封效果。动态光散射（DLS）分析显示，Ru@ACEI的水动力直径约为228 nm，与Ru纳米颗粒的直径（约199 nm）相近，且ζ电位分析表明，Ru@ACEI在ACEI负载后仍保持稳定的电荷状态，确保了良好的胶体稳定性。

为了评估Ru@ACEI的催化活性和生物安全性，研究团队进行了多种实验。首先，通过紫外-可见分光光度计对Ru@ACEI的过氧化氢（H?O?）清除能力进行了检测。结果表明，Ru@ACEI的H?O?清除效率与Ru纳米颗粒相当，说明ACEI的负载并未影响Ru纳米颗粒的内在抗氧化能力。此外，通过CCK-8试剂盒检测了不同细胞系（如内皮细胞、成纤维细胞和角质形成细胞）在Ru@ACEI处理后的细胞毒性。结果显示，Ru@ACEI在48小时的暴露下对这些细胞无显著毒性，且细胞活力保持在较高水平，表明其具有良好的生物相容性。

在体内实验中，研究团队使用了链脲佐菌素（STZ）诱导的1型糖尿病小鼠模型，以评估Ru@ACEI的抗炎和促进伤口愈合效果。实验结果表明，Ru@ACEI治疗组的小鼠伤口愈合速度显著快于其他治疗组，平均愈合时间仅为13.87天，远低于未治疗组的21.97天。同时，通过ELISA检测了治疗后小鼠的血清中关键促炎因子（如C-反应蛋白CRP和促炎性蛋白PCT）的水平，发现Ru@ACEI治疗组的这些因子水平显著下降，分别为92.57%和94.12%。这表明Ru@ACEI不仅能够加速局部伤口愈合，还能有效抑制全身炎症反应，从而打破糖尿病伤口中常见的慢性炎症循环。

此外，通过Masson三色染色评估了伤口组织中胶原蛋白的沉积情况。结果显示，Ru@ACEI治疗组的胶原蛋白沉积明显优于其他组，这有助于改善伤口愈合后期的瘢痕形成。免疫荧光染色进一步证实了Ru@ACEI在减少ROS积累和炎症反应方面的有效性，显示了其在体内具有显著的抗氧化和抗炎作用。通过qPCR和Western blot分析，研究团队发现Ru@ACEI能够显著下调NLRP3、Caspase-3和Caspase-9等与凋亡和炎症相关的基因和蛋白表达水平，从而抑制了这些通路的激活。

尽管Ru@ACEI展现出良好的治疗效果，但研究团队也意识到在临床转化过程中仍存在一些挑战。例如，如何在保持批次一致性的同时扩大合成规模，如何评估其长期生物安全性和生物分布情况，以及如何在成本效益方面与其他现有疗法进行比较。此外，还需要进一步研究其在不同糖尿病伤口模型中的疗效，并满足监管要求，以确保其作为组合纳米治疗药物的合规性。

综上所述，Ru@ACEI作为一种多功能纳米平台，能够通过整合ROS清除与糖尿病伤口微环境调控，为治疗慢性糖尿病伤口提供了一种新的思路。其双重作用机制不仅能够有效缓解氧化应激和凋亡，还能调节炎症反应，从而促进伤口愈合。尽管在临床转化过程中仍需克服诸多挑战，但这项研究为开发针对慢性伤口及其他与氧化应激相关的疾病提供了坚实的理论基础和实验支持。未来的研究将聚焦于优化制造工艺、进行符合良好实验室规范（GLP）的毒理学研究，并在更复杂的糖尿病伤口模型中验证其疗效。Ru@ACEI的抗氧化和抗炎机制也暗示了其在其他相关疾病（如心血管疾病、神经退行性疾病等）中的潜在应用价值。